Білки синтезуються з двадцяти амінокислот, попередниками яких є різні інтермедіати катаболізму, що дають вуглецеві скелети. Усі амінокислоти (рис. 8.15, а) діляться на групи відповідно до свого біосинтетичного походження. Синтез амінокислот групи глутамінової кислоти (глутамінова кислота, глутамін, аргінін, пролін) бере початок від а-кетоглутарату, інтермедіату циклу Кребса. Інший інтермедіат ЦТК, оксалоацетат, дає початок ланцюгу реакцій, що призводять до утворення аспарагінової кислоти, аспарагіну, метіоніну, треоніну, ізолейцину та лізину (група аспарагінової кислоти). Синтези групи ароматичних амінокислот (триптофану, фенілаланіну та тирозину) починаються з конденсації ФЕП з гліколітичного шляху та еритрозо-4-фосфату з пентозофосфатного шляху. Інші інтермедіати гліколізу, 3-ФГК та піруват, дають початок реакціям, що призводять до синтезу амінокислот групи серину (серин, гліцин, цистеїн) та групи піро- виноградної кислоти (аланін, валін, лейцин) відповідно. Біосинтез гістидину сильно відрізняється від синтезу інших амінокислот і тісно пов'язаний із шляхами утворення пуринів. Два атоми вуглецю п'ятичленного імідазольного кільця і три атоми вуглецю бічного ланцюга походять з фосфорибозилпірофосфату. Фрагмент С-N цього кільця утворюється з пуринового ядра АТФ, інший атом азоту - з глутаміну.
З шляхами біосинтезу амінокислот пов'язано утворення ряду важливих сполук азоту містять клітини. Так, пара-оксибензойна і пара-амінобензойна кислоти утворюються на шляхах біосинтезу групи ароматичних амінокислот, поліаміни (путресцин, спермідин, спермін) - групи глутамінової кислоти, діамінопімелінова і дипіколінової кислоти - групи аспарагінової кислоти, пантотенова кислота , а пурини та порфірини - групи серину.
Біосинтез білків (рис. 8.15, б)відбувається в процесі трансляції і для свого здійснення вимагає присутності не тільки ферментів та мономерів (амінокислот), а й матриці (молекули іРНК), що задає послідовність приєднання амінокислот до зростаючого ланцюга, а також специфічного переносника для активування мономеру та відбору його відповідно до заданого коду (ТРНК). Генетичний кодуніверсальний всім живих організмів, у ньому кожна трійка нуклеотидів позначає певну амінокислоту. Активування амінокислоти здійснюється шляхом її приєднання до «своєї» тРНК із витратою енергії АТФ. Молекула тРНК має область, що зв'язує амінокислоту, петлю,
Мал. 8.15. Синтез білка:
а-узагальнена формула амінокислот; 6 - процес трансляції розпізнає трійку нуклеотидів на іРНК, та ділянки приєднання до рибосоми та ферменту. «Переклад» знаків генетичного коду послідовності нуклеотидів іРНК до літер ланцюжка амінокислот білка (трансляцію) здійснює рибосома. Рибосома забезпечує взаємодію трійки нуклеотидів іРНК, тРНК, навантаженої відповідною амінокислотою, і ферменту пептидилтрансферази, що утворює пептидні зв'язки між останньою амінокислотою зростаючого поліпептиду і амінокислотою, що знову надійшла. Звільнена тРНК викидається з рибосоми, а іРНК «просмикується» через рибосому, тому всередині виявляється наступна трійка нуклеотидів. Трансляція триває, поки рибосома не досягне спеціальної ділянки термінації на молекулі іРНК, де поліпептидний ланцюг відокремлюється від рибосоми, а сама рибосома розпадається на субодиниці. Зазвичай, до однієї молекули іРНК прикріплюється велика кількість рибосом, утворюючи полісому (рис. 8.16).
Поліпептидний ланцюжок, що росте від N-кінця (аміногрупи) до С-кінця (карбоксильної групи), виходячи з рибосоми, певним чином згортається. За рахунок утворення водневих зв'язків між різними амінокислотними залишками ділянки поліпептиду набувають вторинної структури у вигляді спіралі або площини. Ці ділянки складаються
Мал. 8.16.
у тривимірну освіту (третинну структуру), що підтримується дисульфідними та гідрофобними взаємодіями. Об'єднання кількох таких молекул призводить до утворення четвертинної структури. Багато білків проявляють ферментативну активність тільки при формуванні третинної та четвертинної структури. Трансляція прокаріотів може починатися ще до завершення процесу транскрипції.
Тема сьогоднішньої лекції – синтез ДНК, РНК та білків. Синтез ДНК називається реплікацією або редуплікацією (подвоєнням), синтез РНК - транскрипцією (переписування з ДНК), синтез білка, який проводиться рибосомою на матричній РНК називається трансляцією, тобто перекладаємо з язика нуклеотидів на мову амінокислот.
Ми постараємося дати короткий оглядвсіх цих процесів, водночас зупиняючись докладніше на молекулярних деталях, щоб ви отримали уявлення, яку глибину цей предмет вивчений.
Молекула ДНК, що складається із двох спіралей, подвоюється при розподілі клітини. Подвоєння ДНК ґрунтується на тому, що при розплетенні ниток до кожної нитки можна добудувати комплементарну копію, таким чином отримуючи дві нитки молекули ДНК, що копіюють вихідну.
Тут також вказано один із параметрів ДНК, це крок спіралі, на кожен повний виток припадає 10 пар основ, зауважимо, що один крок - це не між найближчими виступами, а через один, тому що у ДНК є мала борозенка і велика. Через велику борозенку з ДНК взаємодіють білки, які розпізнають послідовність нуклеотидів. Крок спіралі дорівнює 34 ангстрем, а діаметр подвійної спіралі – 20 ангстрем.
Реплікацію ДНК здійснює фермент ДНК-полімераза. Цей фермент здатний нарощувати ДНК тільки на 3 - кінці. Ви пам'ятаєте, що молекула ДНК антипаралельна, різні її кінці називаються 3 - кінець і 5 - кінець. При синтезі нових копій на кожній нитці одна нова нитка подовжується в напрямку від 5 до 3, а інша - в напрямку від 3 до 5-кінця. Однак 5 кінець ДНК-полімераза нарощувати не може. Тому синтез однієї нитки ДНК, тієї, яка росте в "зручному" для ферменту напрямку, йде безперервно (вона називається лідируюча або провідна нитка), а синтез іншої нитки здійснюється короткими фрагментами (вони називаються фрагментами Оказакі на честь вченого, який їх описав). Потім ці фрагменти зшиваються, і така нитка називається запізнюваною, загалом реплікація цієї нитки йде повільніше. Структура, що утворюється під час реплікації, називається реплікативною вилкою.
Якщо ми подивимося в ДНК бактерії, що реплікується, а це можна спостерігати в електронному мікроскопі, ми побачимо, що у неї спочатку утворюється "око", потім він розширюється, врешті-решт вся кільцева молекула ДНК виявляється реплікованою. Процес реплікації відбувається з великою точністю, але з абсолютної. Бактеріальна ДНК-полімераза робить помилки, тобто вставляє не той нуклеотид, який був у матричній молекулі ДНК приблизно з частотою 10 -6 . У еукаріотів ферменти працюють точніше, так як вони складніше влаштовані, рівень помилок при реплікації ДНК у людини оцінюється як 10 -7 - 10 -8 . Точність реплікації може бути різною на різних ділянках геном, є ділянки з підвищеною частотою мутацій і є більш консервативні ділянки, де мутації відбуваються рідко. І в цьому слід розрізняти два різні процеси: процес появи мутації ДНК і процес фіксації мутації. Адже якщо мутації ведуть до смерті, вони не виявляться в наступних поколіннях, а якщо помилка не смертельна, вона закріпиться в наступних поколіннях, і ми зможемо її прояв спостерігати і вивчити. Ще однією особливістю реплікації ДНК і те, що ДНК-полимераза неспроможна розпочати процес синтезу сама, їй потрібна «затравка». Зазвичай як така затравка використовується фрагмент РНК. Якщо йдеться про геном бактерії, то є спеціальна точка звана origin (витік, початок) реплікації, в цій точці знаходиться послідовність, яка розпізнається ферментом, що синтезує РНК. Він відноситься до класу РНК-полімераз, і в даному випадку називається праймаз. РНК-полімерази не потребують затравки, і цей фермент синтезує короткий фрагмент РНК - ту саму «затравку», з якої починається синтез ДНК.
Наступний процес – транскрипція. На ньому зупинимося докладніше.
Транскрипція – синтез РНК на ДНК, тобто синтез комплементарної нитки РНК на молекулі ДНК здійснюється ферментом РНК-полімеразою. У бактерій, наприклад, кишкової палички – одна РНК-полімераза, і всі бактеріальні ферменти дуже схожі один на одного; у вищих організмів (еукаріотів) - кілька ферментів, вони називаються РНК-полімераза I, РНК-полімераза II, РНК-полімераза III, вони також мають схожість з бактеріальними ферментами, але влаштовані складніше, до їх складу входить більше білків. Кожен вид еукаріотичної РНК-полімерази має свої спеціальні функції, тобто транскрибує певний набір генів. Нитка ДНК, яка є матрицею для синтезу РНК при транскрипції називається смисловою або матричною. Друга нитка ДНК називається некодуючою (комплементарна їй РНК не кодує білки, вона "безглузда").
У процесі транскрипції можна назвати три етапу. Перший етап - ініціаціяТранскрипція - початок синтезу нитки РНК, утворюється перший зв'язок між нуклеотидами. Потім йде нарощування нитки, її подовження - елонгація, і, коли синтез завершено, відбувається термінація, звільнення синтезованої РНК РНК-полімераза при цьому "злазить" з ДНК і готова до нового циклу транскрипції. Бактеріальна РНК-полімераза вивчена дуже детально. Вона складається з декількох білкових-субодиниць: двох α-субодиниць (це маленькі субодиниці), β- і β-субодиниць (великі субодиниці) і ω-субодиниці. Разом вони утворюють так званий мінімальний фермент, або корфермент. До цього кор-ферменту може приєднуватися σ-субодиниця. σ-субодиниця необхідна для початку синтезу РНК, для ініціації транскрипції. Після того, як ініціація здійснилася, σ-субодиниця від'єднується від комплексу, і подальшу роботу (елонгацію ланцюга) веде корфермент. При приєднанні до ДНК σ-субодиниця розпізнає ділянку, на якій повинна починатися транскрипція. Він називається промотор. Промотор - це послідовність нуклеотидів, які вказують початку синтезу РНК. Без σ-субодиниці кор-фермент промотор розпізнати не може. σ-субодиниця разом із кор-ферментом називається повним ферментом, або холоферментом.
Зв'язавшись із ДНК, а саме з промотором, який розпізнала σ-субодиниця, холофермент розплітає двониткову спіраль і починає синтез РНК. Ділянка розплетеної ДНК - це точка ініціації транскрипції, перший нуклеотид, до якого повинен бути комплементарно приєднаний рибонуклеотид. Ініціюється транскрипція, σ-субодиниця йде, а кор-фермент продовжує елонгацію ланцюга РНК. Потім відбувається термінація, кор-фермент звільняється і стає готовим до нового циклу синтезу.
Як відбувається елонгація транскрипції?
РНК нарощується на 3-кінці. Приєднання кожного нуклеотиду кор-фермент робить крок по ДНК і зсувається на один нуклеотид. Оскільки все у світі відносно, можна сказати, що кор-фермент нерухомий, а крізь нього «протягується» ДНК. Зрозуміло, що результат буде таким самим. Але ми говоритимемо про рух молекулою ДНК. Розмір білкового комплексу, що становить корфермент, 150 Ǻ. Розміри РНК-полімерази – 150×115×110Ǻ. Тобто це така наномашина. Швидкість роботи РНК-полімерази – до 50 нуклеотидів за секунду. Комплекс кор-ферменту з ДНК та РНК називається елонгаційним комплексом. У ньому міститься ДНК-РНК гібрид. Тобто це ділянка, на якій ДНК спарена з РНК, і 3-кінець РНК відкритий для подальшого зростання. Розмір цього гібрида – 9 пар основ. Розплетена ділянка ДНК займає приблизно 12 пар основ.
РНК-полімераза пов'язана з ДНК перед розплетеною ділянкою. Ця ділянка називається переднім дуплексом ДНК, її розмір - 10 пар основ. Полімераза пов'язана також з більш довгою частиною ДНК, що називається заднім дуплексом ДНК. Розмір матричних РНК, що синтезують РНК-полімерази у бактерій, можуть досягати 1000 нуклеотидів і більше. В еукаріотичних клітинах розмір синтезованих РНК може досягати 100 000 і навіть декількох мільйонів нуклеотидів. Щоправда, невідомо, чи існують вони у таких розмірах у клітинах, чи процесі синтезу вони можуть встигнути процесувати.
Елонгаційний комплекс досить стабільний, т.к. він має виконати велику роботу. Тобто, сам по собі він із ДНК не «звалиться». Він здатний переміщатися ДНК зі швидкістю до 50 нуклеотидів в секунду. Цей процес називається переміщення (або транслокація). Взаємодія ДНК з РНК-полімеразою (кор-ферментом) не залежить від послідовності цієї ДНК, на відміну від σ-субодиниці. І кор-фермент під час проходження певних сигналів термінації завершує синтез ДНК.
Розберемо докладніше молекулярну структуру кор-фермента. Як було сказано вище, корфермент складається з α- і β-субодиниць. Вони з'єднані так, що утворюють як би "пащу" або "клешню". α-субодиниці знаходяться в основі цієї «клешні», і виконують структурну функцію. З ДНК та РНК вони, мабуть, не взаємодіють. ω-субодиниця – невеликий білок, який також виконує структурну функцію. Основна частина роботи припадає на частку β- і β-субодиниць. На малюнку β-субодиниця показана нагорі, а β-субодиниця - внизу.
Усередині "пащі", яка називається головним каналом, знаходиться активний центр ферменту. Саме тут відбувається поєднання нуклеотидів, утворення нового зв'язку при синтезі РНК. Головний канал у РНК-полімеразі – це те місце, де під час елонгації знаходиться ДНК. Ще в цій структурі збоку є так званий вторинний канал, яким подаються нуклеотиди для синтезу РНК.
Розподіл зарядів лежить на поверхні РНК-полимеразы забезпечує її функції. Розподіл дуже логічний. Молекула нуклеїнової кислоти заряджена негативно. Тому порожнина головного каналу, де має утримуватись негативно заряджена ДНК, викладена позитивними зарядами. Поверхня РНК-полімерази виконана негативно зарядженими амінокислотами, щоб до неї ДНК не прилипала.
РНК-полімераза працює як молекулярна машина, і в ній є різні деталі, кожна з яких виконує свою функцію. Наприклад, частина «β-субодиниці», що нависає над "пащею", утримує передній ДНК-дуплекс. Ця частина називається "заслінкою". Після зв'язування з ДНК заслінка опускається, проходячи шлях у 30 ангстрем, і затискає ДНК так, щоб вона не могла випасти в процесі транскрипції.
всередині "пащі" знаходиться активний центр РНК-полімерази, тобто те місце, де безпосередньо відбувається комплементарна взаємодія рибонуклеоіздтрифосфату, що надійшов по бічному каналу з ДНК-матрицею. Якщо знову прибув нуклеотид комплементарний матриці, він ферментативно пришивається до вільного 3" -кінцю РНК. За характером реакція утворення нового зв'язку в РНК належить до реакцій нуклеофільного заміщення. У ній беруть участь два іона магнію. Один іон постійно перебуває в активному центрі, а другий іон магнію надходить з нуклеотидом і після утворення нового зв'язку між рибонуклеотидами йде, потім надходить новий нуклеотид зі своїм новим іоном магнію.
При виході з РНК-полімерази ДНК-РНК гібрид повинен бути розплетений. У цьому бере участь структура, яка називається "шип".
У транслокації, тобто переміщенні РНК-полімерази по нитці ДНК, бере участь α-спіральна структура, що знизу вгору стирчить з β-субодиниці.
Як дізналися, яка частина ферменту яку роль виконує. Молекулярні біологи надходять у такий спосіб. Вони видаляють частину білкової послідовності та дивляться, яка функція зникла. Було показано, що коли викинути фрагмент затиску (коли його викидали, ще знали, що він тримає ДНК), то ДНК триматися нічого очікувати. Такий самий результат виходить, якщо видалити ДНК переднього дуплексу. Решта - РНК-ДНК гібрид і задній дуплекс - виявляються слабо пов'язаними з РНК-полімеразою.
Відомо, що магній координує зв'язок між фосфатами зростаючої молекули ДНК і фосфатами нуклеотидів, що знову входять. При цьому відбувається послідовність реакцій, які називаються реакціями нуклеофільного заміщення. Відомо, як змінюються зв'язки всередині цього комплексу. Новий нуклеотид приходить, будучи пов'язаним із ще одним іоном магнію. Новий нуклеотид таким чином взаємодіє з зростаючим ланцюгом ДНК. Наприкінці реакції другий іон магнію виводиться з активного центру ферменту.
РНК-полімераза є представником молекулярних машин. Крім того, що на початку синтезу ДНК опускається заслінка, змінюється конформація інших частин РНК-синтази, в ній під час зростання ланцюга РНК відбуваються циклічні зміни, не такі сильні, як на початку синтезу ланцюга. На початку заслінка опускається на 30 Ǻ, а при кожному кроці ферменту ДНК простягається на один нуклеотид. У переміщенні ДНК бере участь елемент РНК-полімерази F-спіраль (альфа-спіральна структури, що точить з бета-субодиниці вгору в головний канал). F-спіраль у своїй згинається, переміщається разом із комплексом РНК-ДНК, звільняється від нього і знову випрямляється. Переміщається F-спіраль за крок на 3,4 Ǻ. Саме такий крок у РНК-полімерази.
Зміна конформації різних частин РНК-полімерази відбувається за рахунок зміни потенційної енергії, що пов'язано з електростатичними та гідрофобними взаємодіями. Можна провести таку аналогію. Якщо взяти тацю з гіркою яблук, то після того, як ми цю тацю потрясемо, яблука будуть розсипатися рівним шаром по таці. У них зміниться потенційна енергія, пов'язана з дією сили тяжіння. Якщо молекулу РНК-синтази «потрясти» (а «трясе» її, як і й інші молекули у клітині, броунівський рух), вона почне приймати конформацію з нижчою потенційної енергією. Тобто джерелом руху молекулярної машини є енергія теплового руху окремих її складових, а пристрій машини такий, що цей рух призводить до потрібного результату. При цьому молекулярна машина споживає енергію, яка в основному йде на зміну стану тих чи інших зв'язків.
Зараз зупинимося на ініціації транскрипції. Як мовилося раніше, ініціація здійснюється з участю σ-субодиницею. Вона взаємодіє зі структурою ДНК, яка називається промотором. Вона має таку структуру у кишкової палички. За десять нуклеотидів до точки ініціації знаходиться Тата-бокс. Не обов'язково стоїть саме така послідовність, але вона є "ідеальною" послідовністю для взаємодії з σ-субодиницею, тобто такою, з якою транскрипція ініціюється найбільш ефективно. Заміна окремих нуклеотидів у цій послідовності знижує ефективність ініціації транскрипції. Ще приблизно за 35 нуклеотидів до нього знаходиться структура, яка називається «-35». Цю послідовність також розпізнає σ-субодиниця. Цю структуру (поєднання послідовностей "-10" та "-35") назвали класичним промотором, т.к. вона була описана першою. Але виявилося, що пристрій промотора може бути іншим. Цей варіант включає той самий ТАТА-бокс, але немає послідовності «-35», проте є додатково два нуклеотиди, і цього достатньо, щоб σ-субодиниця розпізнала промотор.
Ця структура називається розширеним промотором. σ-субодиниця РНК-полімерази сідає на промотор в ДНК і різними частинами білкової молекули взаємодіє з частинами промотора. Розпізнає його σ-субодиниця через велику борозенку ДНК. Після того, як σ-субодиниця у складі кор-фермента зв'язалася з промотором, ДНК на цій ділянці починає плавитися (розплітаються нитки ДНК). Минулої лекції обговорювалося, що в парі А-Т зв'язкуміж нуклеотидами розриваються легше, ніж у парі Г-Ц, Так як остання містить 3 водневі зв'язки, а перша - два. Промотор містить пари А-Ттому плавиться він досить легко. І потім починається синтез РНК, зростаючий ланцюг РНК виштовхує σ-субодиницю і відбуваються ще інші зміни, які викликають дисоціацію σ-субодиниці від корферменту.
Тепер наведемо приклад, як вивчають функції різних частин білка. Якщо невеликий шматочок білка відрізати і подивитися, як змінилися функції білка, можна зрозуміти, які функції відрізаного шматочка. У нашому випадку зробили інакше. Взяли дві ДНК-полімерази, одну взяли з кишкової палички, а іншу - з теплолюбної бактерії (термофільної), яка росте при 800 С, (у лабораторних умовах їх вирощують у колбі, яка знаходиться у термостаті у майже киплячій воді, у природних умовах вони живуть у гарячих джерелах, є такі, які можуть жити при 98оС), отже оптимум роботи її РНК-полімерази та σ-субодиниці - 80оС, (на малюнку σ-субодиниця термофільної бактерії показана червоним, а кишкової палички - жовтим), а у кишкової палички найбільш ефективна робота йде за температури людського тіла, (оскільки вона живе в кишечнику). У її σ-субодиниці всього чотири частини, розрізали білок і зшивали цю σ-субодиницю зі шматочком від σ-субодиниці термофільної бактерії. І потім різні шматочки від термофільної бактерії вставляли, замінюючи ними різні фрагменти σ-субодиниці. Потім дивилися, активний отриманий гібридний білок при 200 або ні. Термофільна бактерія за такої температури не працює, для неї це занадто холодно, а кишкова паличка активна. На малюнку видно, що при даній температурі працює тільки та комбінація, при якій у σ-субодиниці перша та друга частина від кишкової палички, а третя та четверта від термофільної бактерії. Таким чином, роблять висновок, що температуру роботи σ-субодиниці визначають перша та друга складові.
Насправді розрізають не білок, а ДНК, потім шматочки ДНК від різних бактерій зшивають разом і потім вводять у бактерію, при активізації цієї частини ДНК синтезується гібридний білок. Ця технологія відноситься до генної інженерії, вона була розроблена у 70-х роках.
Ще однією особливістю транскрипції є те, що кор-фермент бактеріальної клітини той самий, а σ-субодиниці можуть бути різними. У кишкової палички всього 7 σ-субодиниць, вони впізнають різні промотори. Навіщо це потрібно? Якщо клітині терміново потрібно переключити синтез білків з однієї групи генів на іншу, вона може використовувати різні σ-субодиниці. Наприклад, є гени теплового шоку, якщо кишкову паличку підігріти до стану, коли жити їй стане дуже важко, вона включає аварійну систему опору тепловому шоку, опору тим руйнуванням, що сталися у клітині. У цю систему входить той набір генів, який у нормі не повинен працювати, перед цими генами свій особливий промотор. І тоді інша σ-субодиниця, не основна, синтезується та активує ці гени. Тобто зміна субодиниці – це зміна програми роботи генів. Це спосіб регулювання роботи генів.
Перейдемо до трансляції – синтезу білків. Вона проводиться рибосомами. Рибосома складається з двох субчастинок: великої та малої.
Кожна субчастка складається з кількох десятків білків, кожен із яких вже вивчений, відомо, як кожен білок покладено в субчастицю. При дослідженні білків використовують метод електрофорезу, тобто в електричному полі в спеціальному гелі або спеціальному носії молекули білків роз'єднуються залежно від їхнього заряду та молекулярної ваги, тобто під дією поля вони починають рухатися і можуть відсуватися одна від одної на різну відстань. Іншим методом поділу білків є хроматографія, в результаті цього методу на носії отримують цятки, кожен з яких відповідає окремому білку.
Білки у рибосомі тримаються на каркасі, що складається з рибосомної РНК. p align="justify"> Формування рибосоми починається з того, що рибосомна РНК згортається і на неї в певному порядку починають налипати білки. На малюнку представлена рибосомна РНК. У ній самокомплементарні ділянки нитки РНК спаровуються, утворюючи шпильки (вторинна структура), потім РНК згортається (третинна структура РНК), утворюючи каркас субчастинок.
Ще один вид РНК, що у синтезі білка, це транспортна РНК (тРНК). Молекули тРНК відносно невеликі (проти рибосомної чи матричної РНК). Усі тРНК мають загальну вторинну структуру. За рахунок парування комплементарних ділянок молекули тРНК утворюється три "стебла" з петлями на кінцях і одне "стебло", утворене 5"- і 3"-кінцями молекули тРНК (іноді утворюється ще додаткова п'ята петля). Зображення цієї структури схоже на хрест або конюшина. "Голова" на цьому листі представлена антикодонною петлею, тут знаходиться антикодо - ті три нуклеотиди, які комплементарно взаємодіють із кодоном у мРНК. Протилежне антикодонне петлі стебло, утворене кінцями молекули, називається акцепторним стеблом - сюди приєднується відповідна амінокислота. Розпізнають відповідні один одному тРНК та амінокислоти спеціальні ферменти, які називаються аміноацил-тРНК синтетазами. Для кожної амінокислоти є своя аміноацил-тРНК синтетаза.
У рибосомі міститься матрична РНК (мРНК). З кодоном (трьома нуклеотидами) мРНК комплементарно пов'язаний антикодон транспортної РНК, де висить залишок амінокислоти. На малюнку видно таку структуру (тРНК разом з амінокислотою, яка називається аміноцил-тРНК).
Процес трансляції, як і процес транскрипції, пов'язані з переміщенням вздовж молекули нуклеїнової кислоти, різниця у цьому, що рибосома крокує втричі нуклеотиду, тоді як РНК-полимераза - однією.
Аміноцил т-РНК входить у рибосому, комплементарно зв'язуючись з кодоном мРНК, потім відбувається реакція, при якій амінокислотні залишки зв'язуються один з одним, а т-РНК видаляється.
"Словник" для перекладу з мови нуклеотидів на мову амінокислот називається генетичним кодом. Амінокислот - 20, нуклеотидів - 4, число комбінацій з 4 по 2 = 16, а амінокислот 20, тому кодування не двох, а трилітерна, кожна трійка називається кодоном. Кожна амінокислота кодується трьома нуклеотидами мРНК (яка, у свою чергу, кодується ДНК).
У таблиці малюнку бічні стовпці кодують ліву і праву букву кодона, верхній рядок - середню. Наприклад, кодон AUG кодує амінокислоту метіонін. Число комбінацій з 4 по 3 = 64, тобто деякі амінокислоти кодуються кількома кодонами. Три кодони не кодують жодну амінокислоту, вони називаються термінуючими. Коли вони трапляються в мРНК, рибосома припиняє свою роботу і готовий поліпептидний ланцюг викидається назовні.
Таблиця генетичного коду була складена у 60-х роках. Початок поклали Ніренберг та Маттеію. Вони намагалися проводити в пробірці експерименти на клітинних екстрактах, яких було додано штучні матриці РНК. На той час вважалося, що кодони, що складаються з одного нуклеотиду (UUU або ААА), не кодують амінокислоти. Ніренберг і Маттеї використовували поліU-РНК (тобто складається тільки з урацилів) як контроль у своїх дослідах, але саме в цій пробірці пройшла реакція. Стало ясно, що кодон UUU кодує амінокислоту фенілаланін. Потім було складено таблицю генетичного коду.
Генетичний код є універсальним. Він той самий у всіх мікроорганізмів. Є невеликі відмінності у генетичному коді мітохондрій.
Генетичним кодом називається таблиця відповідності кодонів амінокислот. Коли журналісти пишуть про те, що нещодавно розшифровано генетичний код людини – це груба термінологічна помилка. Генетичний код людини розшифрований тоді, коли і всіх інших живих істот - у 60-х роках XX століття. Нещодавно розшифровано геном людини, тобто повну послідовність нуклеотидів усіх молекул ДНК.
У лекції використано зображення РНК-полімерази, надані Андрієм Кульбачинським (Інститут молекулярної генетики РАН).
Майже півстоліття тому, 1953 р., Д. Вотсон і Ф. Крик відкрили принцип структурної (молекулярної) організації генної речовини - дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК). Структура ДНК дала ключ до механізму точного відтворення – редуплікації – генної речовини. Так виникла нова наука – молекулярна біологія. Було сформульовано так звану центральну догму молекулярної біології: ДНК - РНК - білок. Сенс її полягає в тому, що генетична інформація, записана в ДНК, реалізується у вигляді білків, але не безпосередньо, а за допомогою спорідненого полімеру - рибонуклеїнову кислоту (РНК), і цей шлях від нуклеїнових кислот до білків необоротний. Таким чином ДНК синтезується на ДНК, забезпечуючи власну редуплікацію, тобто відтворення вихідного генетичного матеріалу в поколіннях; РНК синтезується на ДНК, у результаті відбувається переписування, чи транскрипція, генетичної інформації у форму численних копій РНК; молекули РНК є матрицями для синтезу білків - генетична інформація транслюється у форму поліпептидних ланцюгів. У спеціальних випадках РНК може переписуватись у форму ДНК ("зворотна транскрипція"), а також копіюватися у вигляді РНК (реплікація), але білок ніколи не може бути матрицею для нуклеїнових кислот (докладніше див.).
Отже, саме ДНК визначає спадковість організмів, тобто набір білків, що відтворюється в поколіннях, і пов'язаних з ними ознак. Біосинтез білка є центральним процесом живої матерії, а нуклеїнові кислоти забезпечують його, з одного боку, програмою, що визначає весь набір і специфіку білків, що синтезуються, а з іншого - механізмом точного відтворення цієї програми в поколіннях. Отже, походження життя у її сучасній клітинній формі зводиться до виникнення механізму успадкованого біосинтезу білків.
БІОСИНТЕЗ БІЛКІВ
Центральна догма молекулярної біології постулює лише шлях передачі генетичної інформації від нуклеїнових кислот до білків і, отже, до властивостей та ознак живого організму. Вивчення механізмів реалізації цього шляху протягом десятиліть, що послідували за формулюванням центральної догми, розкрило набагато різноманітніші функції РНК, ніж бути лише переносником інформації від генів (ДНК) до білків і служити матрицею для синтезу білків.
На рис. 1 представлена загальна схема біосинтезу білка у клітині. РНК-посередник(messenger RNA, матрична РНК, мРНК), що кодує білки, про яку йшлося вище, - це лише один із трьох головних класів клітинних РНК. Основну їхню масу (близько 80%) становить інший клас РНК - рибосомні РНК, які утворюють структурний каркас та функціональні центри універсальних білок-синтезуючих частинок – рибосом. Саме рибосомні РНК відповідальні - як у структурному, і у функціональному відношенні - формування ультрамікроскопічних молекулярних машин, званих рибосомами. Рибосоми сприймають генетичну інформацію як молекул мРНК і, будучи запрограмовані останніми, роблять білки у точній відповідності з цією програмою.
Проте, щоб синтезувати білки, лише інформації чи програми недостатньо - потрібен ще й матеріал, з якого їх можна робити. Потік матеріалу для синтезу білків йде в рибосоми за допомогою третього класу клітинних РНК. РНК-переносників(Трансфер RNA, транспортні РНК, тРНК). Вони ковалентно пов'язують - акцептують - амінокислоти, які є будівельним матеріалом для білків, і у вигляді аміноацил-тРНК надходять у рибосоми. У рибосомах аміноацил-тРНК взаємодіють з кодонами - тринуклеотидними комбінаціями - мРНК, внаслідок чого відбувається декодування кодонів у процесі трансляції.
Рибонуклеїнові кислоти
Отже, маємо набір основних клітинних РНК, визначальних основний процес сучасної живої матерії - біосинтез білка. Це мРНК, рибосомні РНК та тРНК. РНК синтезуються на ДНК за допомогою ферментів - РНК-полімераз, що здійснюють транскрипцію - переписування певних ділянок (лінійних відрізків) двотяжової ДНК у форму однотяжової РНК. Ділянки ДНК, що кодують клітинні білки, переписуються у вигляді мРНК, тоді як для синтезу численних копій рибосомної РНК і тРНК є спеціальні ділянки клітинного геному, з яких йде інтенсивне переписування без подальшої трансляції білки.
Хімічна структура РНК. Хімічно РНК дуже схожа на ДНК. Обидві речовини – це лінійні полімери нуклеотидів. Кожен мономер - нуклеотид - являє собою фосфорильований N-глікозид, побудований з залишку п'ятивуглецевого цукру - пентози, що несе фосфатну групу на гідроксильній групі п'ятого вуглецевого атома (складноефірний зв'язок) і азотисту основу при першому вуглецевому атомі (N-глікозину) Головне хімічне різницю між ДНК і РНК у тому, що цукровий залишок мономеру РНК - це рибоза, а мономеру ДНК - дезоксирибоза, що є похідним рибози, у якому відсутня гідроксильна група при другому вуглецевому атомі (рис. 2).
Азотистих основ і в ДНК, і в РНК чотири види: два пуринових - аденін (А) і гуанін (G) -і два піримідинових - цитозин (С) і урацил (U) або його метильоване похідне тімін (Т).
Урацил характерний для мономерів РНК, а тімін - для мономерів ДНК, і це друга відмінність РНК та ДНК. Мономери – рибонуклеотиди РНК або дезоксирибонуклеотиди ДНК – утворюють полімерний ланцюг за допомогою формування фосфодіефірних містків між цукровими залишками (між п'ятим та третім атомами вуглецю пентози). Таким чином, полімерний ланцюг нуклеїнової кислоти - ДНК або РНК - може бути представлений як лінійний сахаро-фосфатний кістяк з азотистими основами як бічні групи.
Макромолекулярна структура РНК. Принципова макроструктурна відмінність двох типів нуклеїнових кислот полягає в тому, що ДНК - це єдина подвійна спіраль, тобто макромолекула з двох пов'язаних комплементарно полімерних тяжів, спірально закручених навколо загальної осі (див. [ , ]), а РНК - однотяжовий полімер. У той же час взаємодії бічних груп - азотистих основ - один з одним, а також з фосфатами і гідроксилами сахаро-фосфатного кістяка призводять до того, що однотяжовий полімер РНК згортається на себе і скручується в компактну структуру, подібно до згортання поліпептидного ланцюга білка в компактну глобулу . Таким чином, унікальні нуклеотидні послідовності РНК можуть формувати унікальні просторові структури.
Вперше специфічна просторова структура РНК була продемонстрована при розшифровці атомної структури однієї з тРНК у 1974 р. [ , ] (Рис. 3). Згортання полімерного ланцюга тРНК, що складається з 76 нуклеотидних мономерів, призводить до формування дуже компактного глобулярного ядра, з якого під прямим кутом стирчать два виступи. Вони є короткі подвійні спіралі на кшталт ДНК, але організовані з допомогою взаємодії ділянок однієї й тієї ж ланцюга РНК. Один із виступів є акцептором амінокислоти і бере участь у синтезі поліпептидного ланцюга білка на рибосомі, а інший призначений для комплементарної взаємодії з триплетом (кодоном) мРНК, що кодує, в тій же рибосомі. Тільки така структура здатна специфічно взаємодіяти з білком-ферментом, що навішує амінокислоту на тРНК, і рибосомою в процесі трансляції, тобто специфічно "впізнаватись" ними.
Вивчення ізольованих рибосомних РНК дало наступний разючий приклад формування компактних специфічних структур ще більш довгих лінійних полімерів цього типу. Рибосома складається з двох нерівних частин - великої та малої рибосомних субчастинок (субодиниць). Кожна субчастиця побудована з однієї високополімерної РНК та цілого ряду різноманітних рибосомних білків. Довжина ланцюгів рибосомних РНК дуже значна: так, РНК малої субчастинки бактеріальної рибосоми містить понад 1500 нуклеотидів, а РНК великої субчастинки - близько 3000 нуклеотидів. У ссавців, включаючи людину, ці РНК ще більше - близько 1900 нуклеотидів і понад 5000 нуклеотидів у малій та великій субчастинках відповідно.
Було показано, що ізольовані рибосомні РНК, відокремлені від своїх білкових партнерів та отримані в чистому вигляді, самі здатні спонтанно згортатися в компактні структури, за своїми розмірами та формою схожі на рибосомні субчастинки]. Форма великої та малої субчастиць різна, і відповідно відрізняється форма великої та малої рибосомних РНК (рис. 4). Таким чином, лінійні ланцюги рибосомної РНК самоорганізуються в специфічні просторові структури, що визначають розміри, форму і, мабуть, внутрішній пристрій рибосомних субчастинок, а отже, і всієї рибосоми.
Мінорні РНК. У міру вивчення компонентів живої клітини та окремих фракцій тотальної клітинної РНК з'ясовувалося, що трьома головними видами РНК справа не обмежується. Виявилося, що у природі існує безліч інших видів РНК. Це насамперед так звані "малі РНК", які містять до 300 нуклеотидів, часто з невідомими функціями. Як правило, вони асоційовані з одним або декількома білками і представлені в клітці у вигляді рибонуклеопротеїдів - "малих РНП".
Малі РНК присутні у всіх відділах клітини, включаючи цитоплазму, ядро, ядерце, мітохондрії. Більшість тих малих РНП, функції яких відомі, бере участь у механізмах посттранскрипційної обробки основних видів РНК (RNA processing) - перетворенні попередників мРНК на зрілі мРНК (сплайсинг), редагуванні мРНК, біогенезі тРНК, дозріванні рибосомних РНК. Один з найбільш багато представлених у клітинах видів малих РНП (SRP) відіграє ключову роль у транспорті білків, що синтезуються, через клітинну мембрану. Відомі види малих РНК, що виконують регуляторні функції у трансляції. Спеціальна мала РНК входить до складу найважливішого ферменту, відповідального за підтримку редуплікації ДНК у поколіннях клітин – теломерази. Слід сказати, що їх молекулярні розміри можна порівняти з розмірами клітинних глобулярних білків. Таким чином, поступово стає ясно, що функціонування живої клітини визначається не тільки різноманіттям білків, що синтезуються в ній, але і присутністю багатого набору різноманітних РНК, з яких малі РНК значною мірою імітують компактність і розміри білків.
Рибозими. Все активне життя побудована на обміні речовин - метаболізмі, і всі біохімічні реакції метаболізму відбуваються з належними для забезпечення життя швидкостями тільки завдяки високоефективним специфічним каталізаторам, створеним еволюцією. Упродовж багатьох десятиліть біохіміки були впевнені, що біологічний каталіз завжди і всюди здійснюється білками, які називаються ферментами, або ензимами.І ось у 1982-1983 pp. було показано, що в природі є види РНК, які, подібно до білків, мають високоспецифічну каталітичну активність [ , ]. Такі РНК-каталізатори було названо рибозимами.Уявлення про винятковість білків у каталізі хімічних реакційнастав кінець.
В даний час рибосому також прийнято розглядати як рибозим. Справді, всі наявні експериментальні дані свідчать, що синтез поліпептидної ланцюга білка в рибосомі каталізується рибосомної РНК, а чи не рибосомними білками. Ідентифіковано каталітичну ділянку великої рибосомної РНК, відповідальну за каталіз реакції транспептидації, за допомогою якої здійснюється нарощування поліпептидного ланцюга білка в процесі трансляції.
Що ж до реплікації вірусних ДНК, її механізм мало чим відрізняється від редуплікації генетичного матеріалу - ДНК - самої клітини. У випадку вірусних РНК реалізуються процеси, які пригнічені або зовсім відсутні в нормальних клітинах, де вся РНК синтезується тільки на ДНК як на матриці. При інфекції РНК-вірусами ситуація може бути двоякою. В одних випадках на вірусній РНК, як на матриці, синтезується ДНК ("зворотна транскрипція"), а вже на цій ДНК транскрибуються численні копії вірусної РНК. В інших, найцікавіших для нас випадках на вірусній РНК синтезується комплементарний ланцюг РНК, який і служить матрицею для синтезу – реплікації – нових копій вірусної РНК. Таким чином при інфекції РНК-вірусами реалізується принципова здатність РНК детермінувати відтворення своєї власної структури, як це має місце у ДНК.
Мультифункціональність РНК. Підсумовування та огляд знань про функції РНК дозволяють говорити про незвичайну функціональність цього полімеру в живій природі. Можна надати наступний перелік основних відомих функцій РНК.
Генетична реплікативна функція: структурна можливість копіювання (реплікації) лінійних послідовностей нуклеотидів через комплементарні послідовності. Функція реалізується при вірусних інфекціях та аналогічна головній функції ДНК у життєдіяльності клітинних організмів – редуплікації генетичного матеріалу.
Кодуюча функція: програмування синтезу білка лінійними послідовностями нуклеотидів. Це та сама функція, що й у ДНК. І в ДНК, і в РНК одні і ті ж триплет нуклеотидів кодують 20 амінокислот білків, і послідовність триплет в ланцюзі нуклеїнової кислоти є програма для послідовної розстановки 20 видів амінокислот в поліпептидного ланцюга білка.
Структуротворча функція: формування унікальних тривимірних структур. Компактно згорнуті молекули малих РНК принципово подібні до тривимірних структур глобулярних білків, а більш довгі молекули РНК можуть утворювати і більші біологічні частинки або їх ядра.
Функція впізнавання: високоспецифічні просторові взаємодії з іншими макромолекулами (у тому числі білками та іншими РНК) та з малими лігандами. Ця функція, мабуть, основна у білків. Вона заснована на здатності полімеру згортатися унікальним чином та формувати специфічні тривимірні структури. Функція впізнавання є основою специфічного каталізу.
Каталітична функція: специфічний каталіз хімічних реакцій рибозимами. Ця функція аналогічна ензиматичної функції білків-ферментів.
В цілому РНК постає перед нами настільки дивовижним полімером, що, здавалося б, ні часу еволюції Всесвіту, ні інтелекту Творця не мало б вистачити на його винахід. Як можна було бачити, РНК здатна виконувати функції обох принципово важливих життя полімерів - ДНК і білків. Не дивно, що перед наукою і постало питання: а чи не могло виникнення та самодостатнє існування світу РНК передувати появі життя в її сучасній ДНК-білковій формі?
ПОХОДЖЕННЯ ЖИТТЯ
Білково-коацерватна теорія Опаріна. Мабуть, першу наукову, добре продуману теорію походження життя абіогенним шляхом було запропоновано біохіміком А.І. Опарін ще в 20-х роках минулого століття [ , ]. Теорія базувалася на уявленні, що все починалося з білків, і на можливості в певних умовах спонтанного хімічного синтезу мономерів білків – амінокислот – та білковоподібних полімерів (поліпептидів) абіогенним шляхом. Публікація теорії стимулювала численні експерименти у ряді лабораторій світу, які показали реальність такого синтезу у штучних умовах. Теорія швидко стала загальноприйнятою та надзвичайно популярною.
Основним її постулатом було те, що спонтанно виникали в первинному "бульйоні" білковоподібні сполуки об'єднувалися" в коацерватні краплі - відокремлені колоїдні системи (золі), що плавають у більш розбавленому водному розчині. Це давало головну передумову виникнення організмів - відокремлення довкілля, її компартменталізацію Так як деякі білковоподібні сполуки коацерватних крапель могли мати каталітичну активність, то з'являлася можливість проходження біохімічних реакцій синтезу всередині крапель - виникала подібність асиміляції, а значить, зростання коацервату з подальшим його розпадом на частини - розмноженням. Коацерват, що асимілює, зростає і розмножується розподілом, розглядався як прообраз живої клітини (рис. 5).
Все було добре продумано та науково обґрунтовано в теорії, крім однієї проблеми, на яку довго заплющували очі майже всі фахівці у галузі походження життя. Якщо спонтанно, шляхом випадкових безматричних синтезів у коацерваті виникали поодинокі вдалі конструкції білкових молекул (наприклад, ефективні каталізатори, що забезпечують перевагу даному коацервату в зростанні та розмноженні), то як вони могли копіюватися для поширення всередині коацервату, а тим більше для передачі коацерватам- Теорія виявилася нездатною запропонувати вирішення проблеми точного відтворення - всередині коацервату і в поколіннях - одиничних ефективних білкових структур, що випадково з'явилися.
Світ РНК як попередник сучасного життя. Накопичення знань про генетичний код, нуклеїнові кислоти і біосинтез білків призвело до утвердження принципово нової ідеї про ТОМ, що все починалося зовсім не з білків, а з РНК [-]. Нуклеїнові кислоти є єдиним типом біологічних полімерів, макромолекулярна структура яких завдяки принципу комплементарності при синтезі нових ланцюгів (докладніше див.) забезпечує можливість копіювання власної лінійної послідовності мономерних ланок, іншими словами, можливість відтворення (реплікації) полімеру, його мікроструктури. Тому тільки нуклеїнові кислоти, але не білки можуть бути генетичним матеріалом, тобто відтворюваними молекулами, що повторюють свою специфічну мікроструктуру в поколіннях.
З низки міркувань саме РНК, а чи не ДНК, могла бути первинний генетичний матеріал.
По перше,і в хімічному синтезі, і біохімічних реакціях рибонуклеотиди передують дезоксирибонуклеотидам; Дезоксирибонуклеотиди – продукти модифікації рибонуклеотидів (див. рис. 2).
По-друге,у найдавніших, універсальних процесах життєвого метаболізму широко представлені саме рибонуклеотиди, а не дезоксирибонуклеотиди, включаючи основні енергетичні носії типу рибонуклеозид-поліфосфатів (АТФ тощо).
По-третє,реплікація РНК може відбуватися без будь-якої участі ДНК, а механізм редуплікації ДНК навіть у сучасному живому світі вимагає обов'язкової участі РНК-затравки в ініціації синтезу ланцюга ДНК.
По-четверте,володіючи всіма тими ж матричними та генетичними функціями, що і ДНК, РНК здатна також до виконання низки функцій, властивих білкам, включаючи каталіз хімічних реакцій. Таким чином, є всі підстави розглядати ДНК як пізніше еволюційне придбання - як модифікацію РНК, спеціалізовану для виконання функції відтворення та зберігання унікальних копій генів у складі клітинного геному без безпосередньої участі у біосинтезі білків.
Після того, як були відкриті каталітично активні РНК, ідея первинності РНК у походження життя отримала сильний поштовх до розвитку, і була сформульована концепція самодостатнього світу РНК,що передував сучасному життю [ , ]. Можливу схему виникнення світу РНК представлено на рис. 6.
Абіогенний синтез рибонуклеотидів та їх ковалентне об'єднання в олігомери та полімери типу РНК могли відбуватися приблизно в тих самих умовах і в тій самій хімічній обстановці, що постулювалися для утворення амінокислот та поліпептидів. Нещодавно О.Б. Четверин зі співробітниками (Інститут білка РАН) експериментально показали, що принаймні деякі полірибонуклеотиди (РНК) у звичайній водному середовищі здатні до спонтанної рекомбінації, тобто обміну відрізками ланцюга шляхом трансестерифікації. Обмін коротких відрізків ланцюга на довгі повинен призводити до подовження полірибонуклеотидів (РНК), а сама подібна рекомбінація сприятиме структурному різноманіттю цих молекул. Серед них могли б виникати і каталітично активні молекули РНК.
Навіть вкрай рідкісна поява одиничних молекул РНК, які були здатні каталізувати полімеризацію рибонуклеотидів або з'єднання (сплайсинг) олігонуклеотидів на комплементарному ланцюзі як на матриці [ ], означало становлення механізму реплікації РНК. Реплікація самих РНК-каталізаторів (рибозимів) мала спричинити виникнення самореплицирующихся популяцій РНК. Продукуючи свої копії РНК розмножувалися. Неминучі помилки в копіюванні (мутації) і рекомбінації в популяціях РНК, що самореплікуються, створювали все більшу різноманітність цього світу. Таким чином, передбачуваний древній світ РНК - це "самодостатній біологічний світ, у якому молекули РНК функціонували як генетичний матеріал, і як энзимоподобные каталізатори" .
Виникнення біосинтезу білка. Далі на основі світу РНК мало відбуватися становлення механізмів біосинтезу білка, поява різноманітних білків із успадкованою структурою та властивостями, компартменталізація систем біосинтезу білка та білкових наборів, можливо, у формі коацерватів та еволюція останніх у клітинні структури – живі клітини (див. рис. 6). ).
Проблема переходу від стародавнього світу РНК до сучасного білок-синтезуючого світу - найважча навіть для суто теоретичного рішення. Можливість абіогенного синтезу поліпептидів і білковоподібних речовин не допомагає у вирішенні проблеми, оскільки не проглядається ніякого конкретного шляху, як цей синтез міг би бути пов'язаний з РНК і підпасти під генетичний контроль. Генетично контрольований синтез поліпептидів і білків мав розвиватися незалежно від первинного абіогенного синтезу, своїм шляхом, з урахуванням вже існував світу РНК. У літературі запропоновано кілька гіпотез походження сучасного механізму біосинтезу білка у світі РНК, але, мабуть, жодна їх може розглядатися як детально продумана і бездоганна з погляду фізико-хімічних можливостей. Подаю свою версію процесу еволюції та спеціалізації РНК, що веде до виникнення апарату біосинтезу білка (мал. 7), але і вона не претендує на закінченість.
Запропонована гіпотетична схема містить два істотні моменти, які здаються важливими.
По перше,постулюється, що абіогенно синтезовані олігорибонуклеотиди активно рекомбінували за допомогою механізму спонтанної неензиматичної трансестерифікації, приводячи до утворення подовжених ланцюгів РНК і даючи початок їхньому різноманіттю. Саме цим шляхом у популяції олігонуклеотидів і полінуклеотидів могли з'явитися як каталітично активні види РНК (рибозими), так і інші види РНК зі спеціалізованими функціями (рис. 7). Більш того, неензиматична рекомбінація олігонуклеотидів, що комплементарно зв'язуються з полінуклеотидною матрицею, могла забезпечити зшивання (сплайсинг) фрагментів, комплементарних цій матриці, в єдиний ланцюг. Саме таким способом, а не каталізується полімеризацією мононуклеотидів, могло здійснюватися первинне копіювання (розмноження) РНК. Зрозуміло, якщо з'являлися рибозими, що мали полімеразну активність, то ефективність (точність, швидкість і продуктивність) копіювання на комплементарній. матриці мала значно зростати.
ДругийВажливий момент у моїй версії у тому, що первинний апарат біосинтезу білка з'явився з урахуванням кількох видів спеціалізованих РНК до появи апарату ензиматичної (полімеразної) реплікації генетичного матеріалу - РНК і ДНК. Цей первинний апарат включав каталітично активну прорибосомну РНК, що мала пептидил-трансферазну активність; набір про-тРНК, що специфічно зв'язують амінокислоти або короткі пептиди; іншу прорібосомну РНК, здатну взаємодіяти одночасно з каталітичною прорібосомною РНК, про-мРНК та про-тРНК (див. рис. 7). Така система вже могла синтезувати поліпептидні ланцюги за рахунок каталізованої реакції транспептидації. Серед інших каталітично активних білків – первинних ферментів (ензимів) – з'явилися і білки, що каталізують полімеризацію нуклеотидів – реплікази, або НК-полімерази.
Втім, можливо, що гіпотеза про стародавньому світіРНК як попереднику сучасного живого світу так і не зможе отримати достатнього обґрунтування для подолання основної проблеми – науково правдоподібного опису механізму переходу від РНК та її реплікації до біосинтезу білка. Є приваблива та детально продумана альтернативна гіпотеза А.Д. Альтштейна (Інститут біології гена РАН), в якій постулюється, що реплікація генетичного матеріалу та його трансляція - синтез білка - виникали і еволюціонували одночасно і поєднано, починаючи з взаємодії абіогенно синтезованих олігонуклеотидів і аміноацил-нуклеотидилатів - змішаних ангідридів. Але це вже наступна казка… ( "І Шахразаду застиг ранок, і вона припинила дозволені промови".)
Література
. Watson JD, Crick F.H.C. Molecular structure of nucleic acids // Nature. 1953. V. 171. P. 738-740.
. Watson JD, Crick F.H.C. Genetic implications of structure of deoxyribose nucleic acid // Nature 1953 V. 171. P. 964-967.
. Спірін А.С.Сучасна біологія та біологічна безпека // Вісник РАН. 1997. № 7.
. Spirin A.S.На макромолекулярній структурі природного високополімерного рібонуклеїчного хімічного розчину // Journal of Molecular Biology. 1960. V. 2. P. 436-446.
. Kirn S.H., Suddath F.L., Quigley GJ. та ін.Три-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA // Science. 1974. V. 185. P. 435-40.
. Robertas J.D., Ladner J.E., Finch J.T. та ін. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 A resolution // Nature. 1974. V. 250. P. 546-551.
. Vasiliev V.D., Serdyuk I.N., Gudkov A.T., SPIRin A.S. Self-organization of ribosomal RNA // Sturcture, Function and Genetics of Ribosomes / Eds. Hardesty B. and Kramer G. New York: Springer-Verlag, 1986. P. 129-142.
. Baserga SJ., Steitz J.A.Різноманітний світ малих ribo-nucleoproteins // The RNA World / Eds. Gesteland R.F. і Atkins J.F. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1993. P. 359-381.
. Kruger К., Grabowski PJ., Zaug AJ. та ін. Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena
. Bartel D.P., Szostak J.W. Isolation of new ribozymes from a large pool of random sequences // Science. 1993. V. 261. P. 1411-1418.
. Ekland E.H., Bartel D.P. RNA-catalysed RNA polymerization використовуючи nucleoside triphosphates // Nature. 1996 V. 382. P. 373-376.
. Orgel L.E. origin of life - Review of facts and speculations // Trends in Biochemical Sciences. 1998. V. 23. p. 491-495.
. Альтштейн А.Д.Походження генетичної системи: гіпотеза прогенів// Молекулярна біологія. 1987. Т. 21. С. 309-322.
Спірін Олександр Сергійович – академік, директор Інституту білка РАН, член Президії РАН.
Спочатку – кілька загальних положень.
Вся програма хімічних процесів в організмі записана в ДНК – молекулярне сховище генетичної інформації. Зазвичай потік цієї інформації изораживают схемою: ДНК РНК БІЛОК, де представлений процес перекладу генетичного мови нуклеотидних послідовностей в амінокислотні послідовності. Схема ДНК РНК означає біосинтез молекул РНК, нуклеотидна послідовність яких компліментарна якійсь ділянці (гену) молекули ДНК. Цей процес зазвичай називають транскрипцією. Таким чином, синтезується тРНК, рРНК, мРНК. Позначення РНК БІЛОК виражає біосинтез поліпептидних ланцюгів, амінокислотна послідовність яких визначається нуклеотидною послідовністю мРНК за участю тРНК і рРНК. Цей процес називається трансляцією. Обидва процеси відбуваються за участю численних білків, що виконують каталітичні та некаталітичні функції.
Біосинтез РНК.
Для синтезу всіх видів РНК (р, т, м) використовується лише один тип ферментів: ДНК – залежні РНК – полімерази, до складу яких входить міцно пов'язаний іон цинку. Залежно від цього, який вид РНК синтезується, виділяють РНК – полимеразу 1 (каталізує синтез рРНК), РНК – полимеразу 2 (мРНК) і РНК – полимеразу 3 (тРНК). У мітохондріях виявлено ще один тип – РНК – полімеразу 4. Молекулярні маси всіх видів РНК – полімераз лежать у межах 500000 – 600000. весь синтез проходить відповідно до інформації, що міститься у відповідних генах ДНК. З якого джерела не було виділено виділений фермент РНК – полимераза (з тварин, рослин, бактерій), йому характерні такі особливості функціонування in vivo:1) Використовуються трифосфонуклеозиды, а чи не ди- і монофосфонуклеозиды. 2) Для оптимальної активності необхідний кофактор - іон магнію. 3) Фермент використовує лише один ланцюг ДНК як матрицю для синтезу компліментарної копії РНК (чому і синтез - матричний). Послідовне приєднання нуклеотидів відбувається так, що ланцюг нарощується від 5 до 3 кінця (5 - 3 іолімеризація):
Ф – Ф – Ф – 5` Ф – Ф – Ф – 5` Ф – Ф – Ф –5`
5) Для початку синтезу може використовуватися затравальна порція РНК:
Нуклеозидтрифосфат
(РНК)n залишків (РНК)n + 1 + ПФ
РНК – полімераза
У той же час може йти (найчастіше так і буває) полімеризація без затравки, з використанням замість затравальної порції тільки одного нуклеозидтрифосфату (як правило, це АТФ або ГТФ).
6) У ході цієї полімеризації фермент копіює тільки один ланцюг ДНК і пересувається по матриці в напрямку 3 - 5 `. Вибір ланцюга, що копіюється, не випадковий.
7) Ланцюг матричної ДНК містить сигнали ініціації синтезу РНК для ферменту, розташовані у певних положеннях перед початком гена, та сигнали термінації синтезу, розташовані слідом за кінцем гена або групи генів.
8) Для описаних вище процесів може знадобитися суперскручена ДНК, що допомагає дізнаватися сигнали ініціації та термінації синтезу та полегшує зв'язування РНК – полімерази з матрицею.
РНК - полімераза являє собою олігомерний фермент, що складається з 5 субодиниць: альфа, альфа, бета, бета, гама. Певним субодиницям відповідають певні функції: наприклад, бета – субодиниця бере участь у освіті фосфодіефірного зв'язку, гама – субодиниця бере участь у розпізнаванні стартового сигналу.
Ділянка ДНК, що відповідає за первісне зв'язування РНК – полімерази, називається промотором, містить 30 – 60 пар азотистих основ.
Синтез РНК під впливом ДНК – залежної РНК – полімерази відбувається у 3 етапи: ініціація, елонгація, термінація.
1)Ініціація – гамма-субодиниця, перебуваючи у складі РНК – полімерази, сприяє не тільки «розпізнаванню» промоторних ділянок ДНК, а й безпосередньо зв'язується в районі ТАТА – послідовності. Крім того, що ТАТА – ділянка є сигналом для впізнавання, вона, можливо, має і найменшу міцність водневих зв'язків, що полегшує «розплітання» ниток ДНК. Є відомості, що у стимуляції цього процесу бере участь і цАМФ. У розкриття подвійної спіралі ДНК бере участь і гамма-субодиниця РНК - полімерази. При цьому один із ланцюгів ДНК служить матрицею для синтезу нового ланцюга РНК. І як тільки починається цей синтез, гамма-субодиниця відокремлюється від ферменту, і, надалі, приєднується до іншої молекули ферменту, щоб брати участь у новому циклі транскрипції. «Розплетення» ДНК відбувається в міру просування РНК - полімерази по ланцюгу, що кодує. Воно необхідне для правильного утворення компліментарних пар з нуклеотидами, що вбудовуються в ланцюг РНК. Розмір розплетеної ділянки ДНК постійний протягом всього процесу і становить близько 17 пар нуклеотидів на молекулу РНК - полімерази. Один і той самий кодуючий ланцюг можуть одночасно зчитувати кілька молекул РНК – полімерази, але процес відрегульований таким чином, що в кожний момент кожна молекула РНК – полімерази транскрибує різні ділянки ДНК. У той самий час, для ДНК – залежної РНК – полимеразы 3, синтезує тРНК, характерне «впізнавання» внутрішнього промотора.
2)Элонгация, чи продовження синтезу здійснюється РНК – полимеразой, але вже як тетрамера, т.к. гамма-субодиниця вже відщепилась. Новий ланцюг росте шляхом послідовного додавання рибонуклеотидів до вільної 3`-оксигрупи. Швидкість синтезу, наприклад, иРНК альбуміну сироваткового становить до 100 нуклеотидів в секунду. На відміну від ДНК – полімерази (про яку ми говоритимемо нижче), РНК – полімераза не перевіряє правильність новоствореного полінуклеотидного ланцюга. Частота помилок при синтезі РНК становить 1:1000000.
3) Термінація – тут бере участь білковий фактор r(ро). Він не входить до складу РНК – полімерази. Ймовірно, він дізнається термінаторну послідовність нуклеотидів на матриці по одному з механізмів взаємодії гамма-субодиниці та промотору. Термінатор також містить близько 30 - 60 пар нуклеотидів і закінчується серією АТ - пар, хоча для деяких РНК зазначено, що сигнали термінації відстають від гена, що кодує, на 1000 - 2000 підстав. Можливо, що і одна з частинок полімерази бере участь у розпізнаванні термінаторної послідовності. При цьому синтез РНК припиняється і молекула насинтезованого РНК сходить із ферменту. Більшість таким чином синтезованих молекул РНК не є біологічно активними. Швидше, вони є попередниками, які мають перетворитися на зрілі форми під час різних реакцій. Це називається процесингом. Такими реакціями є: (1)Фрагментація довголанцюгових попередників (причому з одного транскрипту може утворитися від 1 до 3 тРНК). (2) Приєднання нуклеотидів до кінців. (3) Специфічна модифікація нуклеотидів (метилювання, сульфування, дезамінування тощо).
Процесинг мРНК має ще одну особливість. Виявилося, іноді інформація, що кодує АК – послідовність у генах, переривається некодирующими послідовностями, тобто. "гени розірваний". Але за транскрипції копіюється весь «розірваний» ген. У цьому випадку при процесингу ендонуклеази, або їх називають рестриктазою, вирізують ділянки, що не кодують (інтрони). Їх виділено нині понад 200. Рестриктазы розщеплюють зв'язку (залежно від виду ферменту) між суворо певними нуклеотидами (наприклад Р – А, Т – А тощо.). Потім лігази зшивають діючі ділянки (екзони). Більшість послідовностей, транскрипти яких представлені в зрілих мРНК, розірвані в геномі від одного до 50 разів некодуючими ділянками (інтронами). Як правило, інтрони значно довші за екзони. Функції інтронів точно не встановлені. Можливо, вони є для фізичного поділу екзонів з метою оптимізації генетичних перебудов (рекомбінацій). Існує і безматричне синтез РНК. Цей процес каталізує фермент полінуклеотидфосфорілаза: нуклДФ+(нуклМФ)n(нуклМФ)n+1+Фк. Цей фермент не вимагає матриці та не синтезує полімер зі специфічною полінуклеотидною послідовністю. Ланцюг РНК йому необхідна лише як затравка. На процес синтезу РНК інгібуючі впливи надає ряд антибіотиків (близько 30). Тут два механізми: (1) зв'язування з РНК-полімеразою, що призводить до інактивування ферменту (наприклад, рифаміцин зв'язується з b одиницею). (2) Антибіотики можуть зв'язуватися з матричною ДНК і блокувати або з'єднання ферменту з матрицею, або переміщення РНК-полімерази ДНК (це, наприклад, актиноміцин Д).
Біосинтез ДНК.
Генетична інформація, укладена в ДНК хромосоми, може бути передана або шляхом точної реплікації, або за допомогою рекомбінації, транспозиції та конверсії:
1) Рекомбінація двох гомологічних хромосом обмінюються генетичним матеріалом.
 |
||||||
 |
||||||
 |
||||||
 |
||||||
2) Транспозиція – здатність переміщення генів хромосомою або між хромосомами. Можливо, це відіграє важливу роль у клітинному диференціювання.
3) Конверсія - однакові послідовності хромосом можуть формувати випадкові пари, а ділянки, що не збігаються, видаляються.
4) Реплікація (це основний вид синтезу ДНК), тобто відтворення «собі подібних».
Головне функціональне значення реплікації – постачання потомства генетичної інформацією. Основний фермент, що каталізує синтез ДНК – це ДНК-полімераза. Виділено кілька видів ДНК-полімерази: 1) альфа – (виділена з ядра) – це основний фермент, пов'язаний із реплікацією хромосом. 2) бета – (так само локалізована в ядрі) – мабуть, беруть участь у репарації та процесах рекомбінації. 3) гамма - (локалізовані в мітохондріях) - ймовірно, бере участь у реплікації мітохондріальних ДНК. Для роботи ДНК-полімерази необхідні такі умови: 1) у середовищі повинні бути присутніми всі 4 дезоксирибонуклеотиди (дАТФ, дГТФ, дЦТФ та ТТФ); 2) для оптимальної активності необхідний ко-фактор: іони марганцю; 3) необхідна присутність копіюваної дволанцюгової ДНК; 4) нуклеотиди приєднуються у напрямку 5` - 3` (5` - 3` - полімеризація); 5) реплікація починається в строго визначеному ділянці і йде одночасно в обох напрямках з приблизно однаковою швидкістю; 6) для початку синтезу може використовуватися як затравальна порція або фрагмент ДНК, або фрагмент РНК, на відміну від синтезу РНК, де можливий синтез окремих нуклеотидів; 7) для реплікації потрібна суперспіралізована молекула ДНК. Але, якщо, як ми говорили вище, для транскрипції (тобто для синтезу РНК) необхідні РНК-полімераза (з гамма-субодиницею для впізнавання та зв'язування з промотором) та білок впізнавання сигналу термінації (фактор r), при реплікації ДНК дія ДНК полімерази доповнюють кілька (близько 10) білків, частина яких є ферментами. Ці додаткові білки сприяють:
1) впізнавання точки початку реплікації ДНК-полімеразою.
2) Локальному розплетенню дуплексу ДНК, що звільняє одиночні ланцюги для копіювання матриці.
3) Стабілізацію розплавленої структури (розплетеної).
4) Освіта затравних ланцюгів для ініціації дії ДНК-полімерази.
5) Бере участь у формуванні та просуванні реплікаційної вилки.
6) Сприяє впізнаванню ділянок термінації.
7) Сприяє суперспіралізації ДНК.
Ми обговорили всі необхідні умови для реплікації ДНК. І так, як уже згадувалося, реплікація ДНК починається в певному місці. Для розплетення батьківської ДНК потрібна енергія, що вивільняється при гідролізі АТФ. На розподіл кожної пари АТ витрачається дві молекули АТФ. Синтез нової ДНК пов'язаний із одночасним розкручуванням батьківської ДНК. Ділянка, де відбувається одночасно розплітання та синтез, називається «реплікаційною вилкою»:
 |
Батьківська ДНК
Знову синтезовані ДНК
Реплікація ДНК відбувається таким чином, що кожен ланцюг батьківської 2-ланцюжкової ДНК є матрицею для синтезу нового компліментарного ланцюга і два ланцюга (вихідний і знову синтезується), з'єднуючись утворюють наступні покоління ДНК. Цей механізм називають напівконсервативною реплікацією. Реплікація ДНК проходить одночасно на 2 ланцюгах, і йде, як вже згадувалося в напрямку 5 - 3. Але ж ланцюги батьківської ДНК різноспрямовані. Проте, ферменту, що веде синтез ДНК у напрямку 3` - 5` немає. Тому, один ланцюг, що копіює материнську з спрямованістю 5` - 3`, буде синтезуватися безперервно (її називають "лідируюча"), другий ланцюг буде синтезуватися теж у напрямку 5` - 3`, але фрагментами по 150 - 200 нуклеотидів, які згодом зшиваються . Цей ланцюг називають «відстає».
Для того, щоб розпочався синтез нової ДНК, необхідна затравка. Ми вже говорили, що затравкою може бути фрагмент ДНК чи РНК. Якщо затравкою служить РНК, це дуже коротка ланцюг, вона містить близько 10 нуклеотидів і називається праймером. Синтезує праймер, комплементарний одному з ланцюгів ДНК, особливий фермент – праймазу. Сигналом для активації праймази є утворення передзатравного проміжного комплексу, що складається з 5 білків. 3`-кінцева група (гідроксильна група кінцевого рибонуклеотиду праймера) і служить затравкою для синтезу ДНК під дією ДНК-полімерази. Після синтезу ДНК РНК-компанент (праймер) гідролізується під дією ДНК-полімерази.
Робота ДНК-полімераз направляється матрицею, тобто нуклеотидний склад новосинтезованої ДНК залежить від характеру матриці. У свою чергу ДНК-полімераза завжди видаляє некомплементарні залишки на кінці затравки, перш ніж продовжувати полімеризацію. Таким чином, реплікація ДНК йде з великою точністю, оскільки спарювання основ перевіряється двічі. ДНК-полімерази здатні нарощувати ланцюги знову синтезованих ДНК, але не здатні каталізувати з'єднання 2 ланцюгів ДНК або замикати один ланцюг (при утворенні кільцевої ДНК). Ці функції виконує ДНК-лігаза, який каталізує утворення фосфодіефірного зв'язку між двома ланцюгами ДНК. Фермент цей активний за наявності вільної - ВІН-групи на 3 `кінці одного ланцюга ДНК та фосфатної групи на 5` кінці іншого ланцюга ДНК. Зшивання ланцюгів відбувається за рахунок енергії АТФ. Оскільки безліч хімічних та фізичних агентів (іонізуюча радіація, УФО, різні хімічні речовини) викликають у ДНК ушкодження (змінюються або втрачаються АТ, розриваються фосфодіефірні зв'язки і.д.), у всіх клітинах є механізми для виправлення цих ушкоджень. ДНК-рестриктаза знаходить ці ушкодження і вирізує пошкоджену ділянку, ДНК-полімераза проводить репараційний (відновлювальний) синтез пошкоджених ділянок у напрямку 5-3. Відновлена ділянка зшивається із залишком ланцюга ДНК-лігазом. Цей метод виправлення змінених чи пошкоджених ділянок називається репарацією. Список інгібіторів реплікації ДНК різноманітний та великий. Одні зв'язуються з ДНК полімеразою, інактивуючи її, інші зв'язуються та інактивують певний допоміжний блок, треті впроваджуються в матричну ДНК, порушуючи її здатність до копіювання, четверті виступають у ролі конкурентних інгібіторів, являючи собою аналог нормальних нуклеотидтрифосфатів. Такими інгібіторами є деякі антибіотики, мутагени, хімічні отрути, антивірусні агенти тощо.
Біосинтез білка (трансляція генів).
Складання поліпептидного ланцюга зі складових її АК є дивовижним і дуже складним процесом, який можна уявити тим, що відбувається в 4 стадії, а саме:
1) активація та відбір АК (АТФ-залежна стадія);
2) ініціація синтезу поліпептидного ланцюга (ГТФ-залежна стадія);
3) елонгація поліпептидного ланцюга (ГТФ-залежна стадія);
4) термінація синтезу поліпептидного ланцюга.
(1) - активація та відбір АК. У всіх типах клітин першою стадією трансляції є АТФ-залежне перетворення кожної АК на комплекс: аміноацил-тРНК. Цим досягається дві мети:
1) підвищується реакційна здатність АК щодо освіти пептидного зв'язку.
2) АК з'єднується зі специфічною тРНК (тобто відбувається відбір). Реакція йде на 2 стадії + Mg++
1) АК + АТФ аміноацил - АМФ + ПФ
аміноацил-тРНК-синтетаза
2) аміноацил-АМФ + тРНК аміноацил-тРНК
аміноацил-тРНК-синтетаза
Аміноацил-тРНК-синтетаза каталізує приєднання аміноацилу (амінокислотного залишку) до 3 `гідроксильної групи кінцевого аденозину. Згадаймо будову тРНК:
Це плече необхідно це плече бере участь у зв'язуванні аміноацил-
Для впізнання тРНК тРНК з рибосомою на місці синтезу білка.
Аміноацил-тРНК-
Петідазою
антикодон
Крім каталітичної активності, аміноацил-тРНК-синтетаза має дуже високу специфічність, «пізнаючись» як амінокислоти, так і відповідні їм тРНК. Передбачається, що клітини містять 20 синтетаз – по одній на кожну АК, тоді тРНК набагато більше (щонайменше 31 -32), оскільки багато АК можуть з'єднаються з двома і навіть із трьома різними молекулами тРНК.
(2)Ініціація – друга стадія синтезу білків.
Для початку трансляції необхідне точне впізнавання першого кодону, розташованого відразу ж за послідовністю мРНК, що не транслюється. Ініціаторним кодоном є АУГ, а ініціатором виступає метіонін-тРНК
МРНК не транслюється транслюється не транслюється
послідовність послідовність послідовність
Перший кодон.
Впізнавання відбувається за допомогою антикодону тРНК. Зчитування відбувається у напрямку 5` - 3`. Це впізнавання вимагає впорядкованої взаємодії з дисоційованими рибосомами, що йде з витратою енергії (ГТФ). Цей процес відбувається за участю додаткових білків, які називають фактори ініціації (ФІ), їх 8. У процесі беруть участь 40S та 60S субодиниць рибосом. Розглянемо докладний механізм ініціації.
1) 40S - субодиниця рРНК зв'язується з областю мРНК, що передує першому кодону. У цьому бере участь ФІ-3.
2) Перша аміноацил-тРНК, що бере участь у трансляції першого кодону, взаємодіє з ГМФ та ФІ-2. Цей комплекс, що утворився в присутності ФІ-1 приєднує тРНК до першого кодону матриці і утворює ініціаторний комплекс з 40S субодиницею рибосоми.
3) Після вивільнення всіх факторів ініціації (ФІ-1,2,3) до ГТФ приєднується 60S субодиниця рибосоми, при цьому відбувається гідроліз ГТФ. Так завершується утворення повної 80S-частинки рибосоми. у такий спосіб утворюється повний ініціаторний комплекс: рибосома – мРНК – тРНК.
Повністю зібрана рибосома містить 2 функціональні ділянки для взаємодії з молекулами тРНК. Пептидильна ділянка (Р-ділянка) – містить поліпептидний ланцюг у складі пептидил-тРНК у комплексі з останнім протрансльованим кодоном мРНК. Аміноацильна ділянка (А-ділянка) містить аміноацил-тРНК, з'єднану з відповідним кодоном, аміноацил-тРНК потрапляє в формується Р-ділянка, залишаючи А-ділянку вільною для наступної Аміноацил-тРНК.
Схематично весь цей процес ми можемо уявити так:
1)40S-субодиниця рибосоми за участю ФІ-3 приєднується до нетранслюючої послідовності мРНК безпосередньо перед першим кодоном.
2)аміноацил-тРНК, що з'єднується з ГТФ і ФІ-2 і за участю ФІ-1 приєднується до першого кодону, при цьому утворює з 40S-субодиницею ініціаторний комплекс.
3) відбувається звільнення ФІ-1,2,3.
4) 60S-субодиниця взаємодіє з ГТФ і потім приєднується до ініціаторного комплексу. Утворюється повна 80S-рибосома, що має Р- ділянку та А-ділянку.
5) після утворення ініціаторного комплексу з першим кодоном, аміноацил-тРНК потрапляє в формується Р-дільниця, залишаючи А-дільниця вільною.
(3) Елонгація – продовження синтезу. На цьому етапі відбувається подовження пептидного ланцюга. У повністю сформованій на стадії ініціації 80S-рибосома, А-ділянка вільна. По суті, у процесі елонгації постійно повторюється цикл із трьох стадій:
1) Правильне розташування наступної аміноацил-тРНК.
2) утворення пептидного зв'язку.
3) переміщення новоствореної пептидил-тРНК з А-ділянки до Р-ділянки.
(1) - приєднання відповідної (наступної) аміноацил-тРНК в А-ділянці вимагає точного впізнавання кодону. Це відбувається за допомогою антикодону тРНК. Приєднання аміноацил-тРНК до рибосоми відбувається завдяки утворенню комплексу, що складається з аміноацил-тРНК, ГТФ та білкових факторів елонгації (ФЕ), їх також кілька. У цьому вивільняється комплекс ФЕ – ГДФ і фосфат. Цей комплекс (ФЕ – ГДФ) потім (за участю ГТФ та інших білкових факторів) знову перетворюється на ФЕ – ГТФ.
(2) - альфа-аміногрупа нової аміноацил-тРНК в ділянці А здійснює нуклеофільну атаку естерефікованої карбоксильної групи пептидил – тРНК, що займає Р-ділянку. Ця реакція каталізується пептидилтрансферазою - білковим компонентом, що входить до складу 60S-субодиниці рибосоми. оскільки АК а аміноацил-тРНК вже активована, для цієї реакції (реакції утворення пептидного зв'язку) додаткової енергії не потрібно. В результаті реакції зростаючий поліпептидний ланцюг виявляється прикріпленим до тРНК, що знаходиться в А-ділянці.
(3) – після видалення пептдильного залишку з тРНК у Р-ділянки, вільна молекула РНК залишає Р-дільницю. Комплекс ФЕ-2 – ГТФ бере участь у переміщенні новоствореної пептидил-тРНК з А-ділянки до Р-ділянки, звільняючи А-дільницю для нового циклу елонгації. Сукупність відділення деацильованої тРНК, пересування новоствореної пептидил-тРНК з А-ділянки до Р-ділянки, а також пересування мРНК щодо рибосоми називається транслокацією. Оскільки на утворення аміноацил-тРНК витрачалася енергія, одержувана при гідролізі АТФ до АМФ, а це еквівалентно енергії гідролізу 2АТФ до 2 АДФ; на приєднання аміноацил-тРНК до А-ділянки була потрібна енергія, одержувана при гідролізі ГТФ до ГДФ, і ще одна молекула ГТФ витрачалася на транслокацію. Ми можемо підрахувати, що на утворення одного пептидного зв'язку потрібна енергія, яка отримується при гідролізі 2 молекул АТФ і 2 молекул ГТФ.
Швидкість нарощування поліпептидного ланцюга (тобто швидкість елонгації) in vivo оцінюється у 10 амінокислотних залишків на секунду. Ці процеси інгібуються різними антибіотиками. Так, пуроміцин блокує транслокацію, з'єднуючись з
Р-дільницею. Стрептоміцин, зв'язуючись із рибосомними білками, порушує впізнавання кодону антикодоном. Хлороміцітин зв'язується з А-дільницею, блокуючи елонгацію. Схематично це можна так: 1) наступна аміноацил-тРНК завдяки впізнанню за допомогою антикодону закріплюється в А-ділянці. Приєднання відбувається у комплексі з ГТФ та ФЕ-1. при цьому вивільняється ГДФ – ФЕ – 1 та Фк, який потім знову перетворюється на ГТФ – ФЕ-1 та бере участь у нових циклах. 2) Відбувається утворення пептидою зв'язку між аміноацил-тРНК, що приєдналася, і пептидом, що знаходиться в Р-ділянці. 3) При утворенні цього пептидного зв'язку від пептиду відокремлюється тРНК і залишає Р-дільницю. 4) Новостворений пептидил-тРНК за допомогою комплексу ГТФ – ФЕ2 переміщається з А в Р-ділянку, а комплекс ГТФ – ФЕ2 гідролізується до ГДФ – ФЕ-2 та Фк. 5) Внаслідок цього переміщення А-дільниця звільняється для приєднання нової аміноацил-тРНК.
(4)-Термінація - завершальний етап синтезу білка. Після багатьох циклів елонгації, в результаті яких синтезується поліпептидний ланцюг білка,
А-ділянці з'являється термінуючий або нонсенс-кодон. У нормі відсутні тРНК, здатні дізнатися про нонсенс-кодон. Їх розпізнають специфічні білки – фактори термінації (R-фактори). Вони специфічно пізнають нонсенс-кодон, зв'язуються з рибосомою поблизу А-ділянки, блокуючи приєднання наступної аміноацил-тРНК. R-фактори за участю ГТФ та пептидилтрансферази забезпечують гідроліз зв'язку між поліпептидом та молекулою тРНК, що займає Р-ділянку. Після гідролізу та вивільнення поліпептиду та тРНК, 80S-рибосома дисоціює на 40S та 60S субодиниці, які потім можуть знову використовуватися в трансляції нових мРНК.
Ми розглянули зростання одного єдиного ланцюга білка на одній рибосомі, приєднаної до однієї молекули мРНК. Насправді процес протікає більш ефективно, оскільки мРНК зазвичай транслюється одночасно не на одній рибосмі, а на рибосомних комплексах (полісомах) і кожна стадія трансляції (ініціація, елонгація, термінація) здійснюється при цьому кожною рибосомою в цій полісомі, у цьому рибосомальному комплексі тобто з'являється можливість синтезу кількох копій поліпептиду, перш ніж мРНК буде розщеплена.
Розміри полісомних комплексів сильно варіюють і зазвичай визначаються розмірами молекули мРНК. Дуже великі молекули мРНК здатні утворювати комплекси із 50 – 100 рибосомами. Найчастіше,комплекс містить від 3 до 20 рибосом.
У клітинах тварин і людини багато білків синтезуються по мРНК у вигляді молекул-попередників, які потім для утворення активних молекул повинні бути модифіковані, за аналогією із синтезом ПК. Залежно від білка можуть відбуватися одна або більша кількістьнаступних модифікацій.
1) Утворення дисульфідного зв'язку.
2) Приєднання ко-фактрів та ко-ферментів.
3) Приєднання простетичних груп.
4) Частковий протеоліз (проінсулін – інсулін).
5) Освіта олігомерів.
6) Хімічна модифікація (ацилювання, амінування, метилювання, фосфорилювання, карбоксилювання тощо) – відомо більше 150 хімічних модифікацій АК у складі молекули білка.
Усі перелічені модифікації призводять до зміни структури та активності білків.
генетичний код.
Те, що передача генетичної інформації ДНК відбувається за допомогою молекули мРНК, вперше припустили в 1961 році Ф.Жакоб і Ж.Моно. Наступні роботи (М.Ніренберг, Х.Г.Корана, РУ.Холлі):
М.Ніренберг – вивчав синтез поліпептидів та зв'язування аміноацил-тРНК з рибосомами.
Х.Г.Корана – розробив метод хімічного синтезу полі- та олігонуклеотидів.
Р.У.Холії – розшифрував структуру ДНК із антикодоновим ділянкою.
1) Підтвердили гіпотезу щодо участі мРНК
2) Показали триплетну природу коду, згідно з якою кожна АК програмується в мРНК 3 основами, названими кодоном
3) Встановили, що код мРНК читається шляхом комплементарного впізнавання кодоном антикодонового триплету тРНК.
4) Встановили відповідність між АК та більшістю з 64 можливих кодонів. В даний час відомо, що 61 кодон кодують АК, а 3 є сигналами термінації (нонсенс-кодон).
Вважалося, що генетичний код універсальний, тобто всім організмів і всіх видів клітин одні й самі значення використовуються всім кодонов. Однак останні дослідження мітохондріальної ДНК показали, що генетична система мітохондрій значною мірою відрізняється від генетичної системи інших утворень (ядра, хлоропластів), тобто тРНК мітохондрій деякі кодони зчитують інакше, ніж тРНК інших утворень. В результаті для мітохондрій необхідно лише 22 види тРНК. Тоді, як синтезу білка в цитоплазмі використовуються 31 – 32 виду тРНК, тобто весь набір тРНК.
18 з 20 АК кодуються більш ніж одним кодоном (2, 3, 4, 6) – ця властивість називається «виродженістю» коду і має важливе значеннядля організму. Внаслідок виродженості деякі помилки при реплікації чи транскрипції не викликають спотворення генетичної інформації. Генетичний код не перекривається і не має знаків пунктуації, тобто зчитування йде без будь-яких перепусток, послідовно, до досягнення нонсенс-кодону. У той же час для вірусів відзначено зовсім іншу властивість – кодони можуть «перекриватися»:
1) Якщо заміна посідає 3-й нуклеотид кодона, то, внаслідок «виродженості» коду, існує можливість, що послідовність АК залишиться незмінною і мутація не проявиться.
2) Може мати місце міссенс-ефект, коли одна АК замінюється іншою; ця заміна може бути прийнятною, частково прийнятною або неприйнятною, тобто функція білка страждає, порушується або повністю втрачається.
3) В результаті мутацій може утворитися нонсенс-кодон. Утворення нонсенс-кодону (термінуючого кодону) може призвести до передчасної термінації синтезу білка.
Підсумовуючи сказане:
1) Генетично код («мова життя») складається з послідовності кодонів, яка, власне, і утворює ген.
2) Генетичний код має триплетність, тобто кожен кодон складається з трьох нуклеотидів, тобто кожен кодон кодує 1 АК. При цьому з 4 видів нуклеотидів ДНК можливе утворення 64 поєднань, що більш ніж достатньо для 20 АК.
3) Код "вироджений" - тобто одна АК може кодуватися 2, 3, 4, 6 кодонами.
4) Код однозначний, тобто один кодон кодує лише одну АК.
5) Код, що не перекривається, відсутні нуклеотиди, що входять у два сусідні кодони.
6) Код «без ком», тобто відсутні нуклеотиди між двома сусідніми кодонами.
8) Послідовність АК у поліпептиді відповідає послідовності кодонів у гені – ця властивість називається коллінеарністю.
Подібна інформація.
Тема сьогоднішньої лекції – синтез ДНК, РНК та білків. Синтез ДНК називається реплікацією або редуплікацією (подвоєнням), синтез РНК – транскрипцією (переписування з ДНК), синтез білка, який проводиться рибосомою на матричній РНК називається трансляцією, тобто перекладаємо з язика нуклеотидів на мову амінокислот.
Ми постараємося дати короткий огляд всіх цих процесів, водночас зупиняючись докладніше на молекулярних деталях, щоб ви отримали уявлення, яку глибину цей предмет вивчений.
Реплікація ДНК
Молекула ДНК, що складається із двох спіралей, подвоюється при розподілі клітини. Подвоєння ДНК ґрунтується на тому, що при розплетенні ниток до кожної нитки можна добудувати комплементарну копію, таким чином отримуючи дві нитки молекули ДНК, що копіюють вихідну.
Тут також вказано один із параметрів ДНК, це крок спіралі, на кожен повний виток припадає 10 пар підстав, зауважимо, що один крок – це не між найближчими виступами, а через один, тому що у ДНК є мала борозенка та велика. Через велику борозенку з ДНК взаємодіють білки, які розпізнають послідовність нуклеотидів. Крок спіралі дорівнює 34 ангстрем, а діаметр подвійної спіралі – 20 ангстрем.
Реплікацію ДНК здійснює фермент ДНК-полімераза. Цей фермент здатний нарощувати ДНК тільки на 3 - кінці. Ви пам'ятаєте, що молекула ДНК антипаралельна, різні її кінці називаються 3 - кінець і 5 - кінець. При синтезі нових копій на кожній нитці одна нова нитка подовжується в напрямку від 5 до 3, а інша - в напрямку від 3 до 5-кінця. Однак 5 кінець ДНК-полімераза нарощувати не може. Тому синтез однієї нитки ДНК, тієї, яка росте в "зручному" для ферменту напрямку, йде безперервно (вона називається лідируюча або провідна нитка), а синтез іншої нитки здійснюється короткими фрагментами (вони називаються фрагментами Оказакі на честь вченого, який їх описав). Потім ці фрагменти зшиваються, і така нитка називається запізнюваною, загалом реплікація цієї нитки йде повільніше. Структура, що утворюється під час реплікації, називається реплікативною вилкою.
Якщо ми подивимося в ДНК бактерії, що реплікується, а це можна спостерігати в електронному мікроскопі, ми побачимо, що у неї спочатку утворюється "око", потім він розширюється, врешті-решт вся кільцева молекула ДНК виявляється реплікованою. Процес реплікації відбувається з великою точністю, але з абсолютної. Бактеріальна ДНК-полімераза робить помилки, тобто вставляє не той нуклеотид, який був у матричній молекулі ДНК приблизно з частотою 10-6. У еукаріотів ферменти працюють точніше, оскільки вони складніше влаштовані, рівень помилок при реплікації ДНК у людини оцінюється як 10-7 - 10 -8 . Точність реплікації може бути різною на різних ділянках геном, є ділянки з підвищеною частотою мутацій і є більш консервативні ділянки, де мутації відбуваються рідко. І в цьому слід розрізняти два різні процеси: процес появи мутації ДНК і процес фіксації мутації. Адже якщо мутації ведуть до смерті, вони не виявляться в наступних поколіннях, а якщо помилка не смертельна, вона закріпиться в наступних поколіннях, і ми зможемо її прояв спостерігати і вивчити. Ще однією особливістю реплікації ДНК і те, що ДНК-полимераза неспроможна розпочати процес синтезу сама, їй потрібна «затравка». Зазвичай як така затравка використовується фрагмент РНК. Якщо йдеться про геном бактерії, то є спеціальна точка звана origin (витік, початок) реплікації, в цій точці знаходиться послідовність, яка розпізнається ферментом, що синтезує РНК. Він відноситься до класу РНК-полімераз, і в даному випадку називається праймаз. РНК-полімерази не потребують затравки, і цей фермент синтезує короткий фрагмент РНК – ту саму «затравку», з якої починається синтез ДНК.
Транскрипція
Наступний процес – транскрипція. На ньому зупинимося докладніше.
Транскрипція – синтез РНК на ДНК, тобто синтез комплементарної нитки РНК на молекулі ДНК, здійснюється ферментом РНК-полімеразою. У бактерій, наприклад, кишкової палички – одна РНК-полімераза і всі бактеріальні ферменти дуже схожі один на одного; у вищих організмів (еукаріотів) – кілька ферментів, вони називаються РНК-полімераза I, РНК-полімераза II, РНК-полімераза III, вони також мають схожість з бактеріальними ферментами, але влаштовані складніше, до їх складу входить більше білків. Кожен вид еукаріотичної РНК-полімерази має свої спеціальні функції, тобто транскрибує певний набір генів. Нитка ДНК, яка є матрицею для синтезу РНК при транскрипції називається смисловою або матричною. Друга нитка ДНК називається некодуючою (комплементарна їй РНК не кодує білки, вона "безглузда").
У процесі транскрипції можна назвати три етапу. Перший етап – ініціація транскрипції – початок синтезу нитки РНК, утворюється перший зв'язок між нуклеотидами. Потім йде нарощування нитки, її подовження - елонгація, і, коли синтез завершено, відбувається термінація, звільнення синтезованої РНК. РНК-полімераза при цьому "злазить" з ДНК і готова до нового циклу транскрипції. Бактеріальна РНК-полімераза вивчена дуже детально. Вона складається з декількох білкових-субодиниць: двох α-субодиниць (це маленькі субодиниці), β- і β-субодиниць (великі субодиниці) і ω-субодиниці. Разом вони утворюють так званий мінімальний фермент, або корфермент. До цього кор-ферменту може приєднуватися σ-субодиниця. σ-субодиниця необхідна для початку синтезу РНК, для ініціації транскрипції. Після того, як ініціація здійснилася, σ-субодиниця від'єднується від комплексу, і подальшу роботу (елонгацію ланцюга) веде корфермент. При приєднанні до ДНК σ-субодиниця розпізнає ділянку, на якій повинна починатися транскрипція. Він називається промотор. Промотор - це послідовність нуклеотидів, які вказують початку синтезу РНК. Без σ-субодиниці кор-фермент промотор розпізнати не може. σ-субодиниця разом із кор-ферментом називається повним ферментом, або холоферментом.
Зв'язавшись із ДНК, а саме з промотором, який розпізнала σ-субодиниця, холофермент розплітає двониткову спіраль і починає синтез РНК. Ділянка розплетеної ДНК – це точка ініціації транскрипції, перший нуклеотид, до якого має бути комплементарно приєднаний рибонуклеотид. Ініціюється транскрипція, σ-субодиниця йде, а кор-фермент продовжує елонгацію ланцюга РНК. Потім відбувається термінація, кор-фермент звільняється і стає готовим до нового циклу синтезу.
Як відбувається елонгація транскрипції?
РНК нарощується на 3-кінці. Приєднання кожного нуклеотиду кор-фермент робить крок по ДНК і зсувається на один нуклеотид. Оскільки все у світі відносно, можна сказати, що кор-фермент нерухомий, а крізь нього «протягується» ДНК. Зрозуміло, що результат буде таким самим. Але ми говоритимемо про рух молекулою ДНК. Розмір білкового комплексу, що становить корфермент, 150 Ǻ. Розміри РНК-полімерази – 150×115×110Ǻ. Тобто це така наномашина. Швидкість роботи РНК-полімерази – до 50 нуклеотидів за секунду. Комплекс кор-ферменту з ДНК та РНК називається елонгаційним комплексом. У ньому міститься ДНК-РНК гібрид. Тобто це ділянка, на якій ДНК спарена з РНК, і 3-кінець РНК відкритий для подальшого зростання. Розмір цього гібрида – 9 пар основ. Розплетена ділянка ДНК займає приблизно 12 пар основ.
РНК-полімераза пов'язана з ДНК перед розплетеною ділянкою. Ця ділянка називається переднім дуплексом ДНК, її розмір – 10 пар основ. Полімераза пов'язана також з більш довгою частиною ДНК, що називається заднім дуплексом ДНК. Розмір матричних РНК, що синтезують РНК-полімерази у бактерій, можуть досягати 1000 нуклеотидів і більше. В еукаріотичних клітинах розмір синтезованих ДНК може досягати 100 000 і навіть декількох мільйонів нуклеотидів. Щоправда, невідомо, чи існують вони у таких розмірах у клітинах, чи процесі синтезу вони можуть встигнути процесувати.
Елонгаційний комплекс досить стабільний, т.к. він має виконати велику роботу. Тобто, сам по собі він із ДНК не «звалиться». Він здатний переміщатися ДНК зі швидкістю до 50 нуклеотидів в секунду. Цей процес називається переміщення (або транслокація). Взаємодія ДНК з РНК-полімеразою (кор-ферментом) не залежить від послідовності цієї ДНК, на відміну від σ-субодиниці. І кор-фермент під час проходження певних сигналів термінації завершує синтез ДНК.
Розберемо докладніше молекулярну структуру кор-фермента. Як було сказано вище, корфермент складається з α- і β-субодиниць. Вони з'єднані так, що утворюють як би "пащу" або "клешню". α-субодиниці знаходяться в основі цієї «клешні», і виконують структурну функцію. З ДНК та РНК вони, мабуть, не взаємодіють. ω-субодиниця – невеликий білок, який також виконує структурну функцію. Основна частина роботи припадає на частку β- і β-субодиниць. На малюнку β-субодиниця показана нагорі, а β-субодиниця - внизу.
Усередині "пащі", яка називається головним каналом, знаходиться активний центр ферменту. Саме тут відбувається поєднання нуклеотидів, утворення нового зв'язку при синтезі РНК. Головний канал у РНК-полімеразі - це те місце, де під час елонгації знаходиться ДНК. Ще в цій структурі збоку є так званий вторинний канал, яким подаються нуклеотиди для синтезу РНК.
Розподіл зарядів лежить на поверхні РНК-полимеразы забезпечує її функції. Розподіл дуже логічний. Молекула нуклеїнової кислоти заряджена негативно. Тому порожнина головного каналу, де має утримуватись негативно заряджена ДНК, викладена позитивними зарядами. Поверхня РНК-полімерази виконана негативно зарядженими амінокислотами, щоб до неї ДНК не прилипала.
