Методи гістологічного дослідження. Сучасна гістологія має широкий арсенал різноманітних методів дослідження. Всі ці методи поєднує вимогу застосування спеціального приладу - мікроскопа, і тому вони всі мікроскопічними методами.
Залежно стану досліджуваного об'єкта ці методи поділяють на вітальні (або Суправитальное), коли вивчаються живі клітини, тканини, органи і навіть цілі організми, і поствітальні, коли досліджують мертві фіксовані об'єкти.
Становлення поствітального методу, або методу виготовлення постійного гістологічного препарату, відбувалося паралельно зі становленням науки гістології в другій половині XIX ст. Його називають ще методом класичної гістології. Цей метод, що називається гістологічною або мікроскопічною технікою, вимагає досить складної підготовки об'єкта дослідження. Остання є предметом написання спеціальних, досить великих за обсягом посібників. Студенту, який починає вивчати гістологію, необхідно ознайомитися з основами техніки виготовлення гістологічних препаратів, щоб краще зрозуміти ці препарати та навчитися аналізувати, "читати", бо саме постійні гістологічні препарати широко використовуються як у навчальному процесі, так і в наукових дослідженнях.
Перший етап при виготовленні препарату – отримання матеріалу. Вже цьому етапі, як і всіх наступних, слід уникати зайвого травмування об'єкта. Тому, вирізаючи шматочок органу чи тканини, треба брати гострі ножиці чи лезо, не стискати тканину пінцетом. Шматочки беруться невеликих розмірів – близько 1 см3 (краще 7x7x3 мм). Матеріал повинен бути свіжим, приймати його потрібно якнайшвидше після забиття експериментальної тварини або смерті людини.
Наступний етап - фіксація матеріалу, здійснюється шляхом занурення взятого шматочка фіксуючі рідини. Метою цього етапу є закріплення гістологічних структур та макромолекул у тому місці та стані, в якому вони були у живому об'єкті. Звичайно фіксатори зумовлюють певні зміни прижиттєвого стану структур, але можна підбором спеціальних фіксованих агентів звести ці зміни до мінімуму. Фіксаторами служать спирти (етиловий, метиловий), розчини формаліну, солі важких металів, кислоти (оцтова, пікринова, осмієва). Найчастіше застосовуються різні складні фіксуючі суміші, що включають названі компоненти різних співвідношеннях.
Третій етап – зневоднення фіксованого матеріалу. Для цього використовують спирти різних концентрацій, що поступово зростають від 50-70 до 100 градусів. Зневоднення необхідне наступного етапу - ущільнення об'єкта, здійснюється у парафіні, целоидини, синтетичних смолах. Переважна більшість цих речовин з водою не змішується, і тому для просочення ними матеріалу необхідно ретельно видалити воду з тканини, а потім просочити її ксилолом (толуолом, бензолом), тобто речовиною, що добре розчиняє парафін, а також змішується зі 100-градусним етиловим спиртом . Після просочення об'єкта рідким парафіном при температурі 55-5б°С йому дають затверджені при кімнатній температурі разом із парафіном у спеціальних формах. Так одержують парафіновий блок. Ця процедура називається заливкою. Прискорене ущільнення досягається шляхом заморожування шматочків тканини сухим льодом (двоокис вуглецю) або рідким азотом, проте структура досліджуваних гістологічних об'єктів зберігається у разі гірше.
Ущільнення матеріалу дозволяє виготовити з нього тонкі (товщиною 5-7 мкм), півтонки (0,5-1 мкм) зрізи, що використовуються для світлової мікроскопії, для електронної мікроскопії використовують ультратонкі зрізи (0,05-0,2 мкм). Виготовлення зрізів проводять на спеціальних приладах-мікротомах (для світлової мікроскопії) та ультрамікротомах (для електронної мікроскопії). Тонкий, тонкий або ультратонкий зрізи є прозорими для світлових променів або пучка електронів об'єктами і дають можливість вивчення їх під відповідними мікроскопами. Для того, щоб розрізняти структурні деталі об'єкта, більшість яких не мають природного розмаїття, отриманий зріз треба фарбувати (для вивчення під світловим мікроскопом) або контрастувати (для електронної мікроскопії).
У гістології існує багато методів фарбування препаратів і застосовується багато різних барвників, залежно від мети дослідження. Гістологічні барвники за походженням поділяються на рослинні, тваринні та синтетичні (анілінові). Прикладом рослинних барвників є гематоксилін, що отримується з кори кампешового дерева, що росте в Центральній Америці, а тварин кармін, який одержують із комах - кошанілі. Абсолютна більшість барвників є синтетичними – еозин, фуксин, азур тощо.
Найважливішою є класифікація гістологічних барвників за хімічним властивостям, оскільки на ній ґрунтується ряд понять та термінів, які зустрічатимуться протягом усього курсу. Отже, за хімічними властивостями гістологічні барвники поділяють на кислі, основні та нейтральні. Властивості кислих барвників обумовлюються групами-СООН,-HS03, Н2Р03, це так звані аніонні барвники. Кислі барвники забарвлюють цитоплазму клітини, їх називають цитоплазматичними. Прикладом таких барвників може бути еозин (дає яскраво-рожевий колір), світлий зелений (дає зелений колір). Гістологічні структури, здатні зафарбовуватися кислими барвниками, називають оксифільними (ацидофільними, еозинофільними). Це, наприклад, цитоплазматичні гранули еозинофільних лейкоцитів, колагенові волокна і т.п.
Основні барвники є катіонними, переважна більшість їх у складі молекули має позитивно заряджені атоми азоту. Названі барвники вибірково забарвлюють ядра клітин і тому їх називають ядерними. Прикладом можуть бути гематоксилін (фарбує в синьо-фіолетовий колір), кармін (у світло-червоний), сафранін (темно-червоний), азур II (у синій). Гістологічні структури, здатні зафарбовуватись основними барвниками, називають базофільними. Це гранули в цитоплазмі базофільних лейкоцитів, ядра клітин тощо.
Нейтральні барвники утворюються у разі повідомлення водних розчинів кислого та основного барвників, наприклад, еозиново-кислий метиленовий синій. Крім того, слід розрізняти нейтральні барвники, коли в розчині одночасно є основний і кислий барвники. Структури, які одночасно сприймають і основні і кислі барвники, називають нейтро профільними, або поліхроматофільними. Прикладом можуть бути гранули нейтро профільних лейкоцитів, цитоплазма поліхроматофільних еритро-бластів тощо. Здатність гістологічних структур змінювати колір основного барвника позначається терміном метахромазії. Метахроматично забарвлюється зернистість базофільних лейкоцитів, міжклітинна речовина хрящової тканини і т.д. Одними з барвників, що найчастіше поєднуються, є гематоксилін і еозин.
Крім кислих, основних та нейтральних барвників існують спеціальні, що використовуються для виявлення певних речовин або структур. Наприклад, судан III забарвлює жирові речовини в помаранчевий колір, а орсеїном – еластичні волокна у бурий.
Фарбовані препарати зазвичай зневоднюють у спиртах, просвічують у ксилолі та заливають тонким шаром канадського бальзаму, накривають покривним склом. Після висихання бальзаму одержують постійний препарат, яким можна користуватися протягом тривалого часу. Для електронної мікроскопії зрізи, одержані на ультрамікротомах, розміщують на спеціальних сіточках, контрастують солями урану або свинцю, переглядають через мікроскоп і фотографують. Отримані мікрофотографії є об'єктом вивчення одночасно із гістологічними препаратами.
Крім описаних тонких зрізів, є ще інші види гістологічних препаратів, які використовують значно рідше, лише в окремих випадках. До них відносяться мазки (крові, кісткового мозку, слини і т.д.), відбитки (печінки, тимусу, слизової оболонки сечового міхура), плівки (сполучної тканини, плеври, очеревини, м'якої мозкової оболонки), тотальні препарати (зародки) ранніх стадійрозвитку, статеві клітини).
Вітальні (прижиттєві) методи дослідження клітин або тканин дають можливість отримати інформацію про те, як у них відбуваються процеси життєдіяльності, простежити рух, поділ, зростання, взаємодію клітин, їхню реакцію на дію різних факторів. Прижиттєві методи дослідження - необхідний доповнення до тих даних, які отримані методом класичної гістології про будову клітин, тканин. Прижиттєві дослідження проводять у живому організмі, тобто in vivo. Для дослідження живих клітин використовують методи вітальне та суправітальне забарвлення. Для цього застосовують спеціальні, не токсичні для живих тканин барвники. При вітальному забарвленні барвник вводять в організм живої тварини і він вибірково забарвлює певні клітини. Так досліджують клітини макрофагічної системи за умови введення тріпанового синього або літієвого карміну. Суправітальне забарвлення - це забарвлення живих клітин, ізольовані з організму. Так виявляють лізосоми (барвник нейтральний червоний), мітохондрії (Янус зелений), ретикулоцити крові (діамант-крезиловий синій).
Для вітального або суправітального, а також поствітального досліджень незабарвлених гістологічних об'єктів використовують ряд спеціальних методів світлової мікроскопії - фазоконтрастну, темнопольову, флуоресцентну.
Метод фазового розмаїття забезпечує необхідну контрастність досліджуваних незабарвлених структур за рахунок спеціальної кільцевої діафрагми, що міститься в конденсор, і так званої фазової пластинки, що міститься в об'єктиві. Така конструкція оптики світлового мікроскопа дозволяє перетворювати фазові зміни світла, що проходить через об'єкт, на амплітудні, які помічає око як зміни яскравості.
Основними Об'єктами дослідження є гістологічні препарати, а основним способом дослідження - мікроскопування.
Гістологічний препарат має бути досить прозорим (тонким) та контрастним. Він виготовляється як із живих, так і з мертвих (фіксованих) структур. Препарат може бути суспензією клітин, мазок, відбиток, плівку, тотальний препарат і тонкий зріз.
Процес виготовлення гістологічних препаратів для мікроскопічних досліджень включає такі основні етапи: 1) взяття матеріалу і його фіксація; 2) ущільнення матеріалу; 3) приготування зрізів; 4) фарбування, або контрастування зрізів; 5) укладання зрізів.
Для фарбування застосовуються спеціальні гістологічні барвники з різним значенням рН: кислі, нейтральні та основні. Структури, що фарбуються ними, відповідно, називаються оксифільними, нейтрофільними (гетерофільними) та базофільними.
Якими методами користується гістологічна наука? Вони досить численні та різноманітні:
Світлова мікроскопія. Сучасні мікроскопи мають високодозвільну здатність. Роздільна здатність визначається найменшою відстанню (d) між двома рядом розташованими точками, які можна бачити окремо. Ця відстань залежить від довжини світлової хвилі (λ) та виражається формулою: d = 1/2 λ.
Мінімальна довжина хвилі видимої частини діапазону 0,4 мкм. Отже, роздільна здатність світлового мікроскопа становить 0,2 мкм, а загальне збільшення досягає 2500 разів.
Ультрафіолетова мікроскопія . Довжина хвилі ультрафіолетового світла - 0,2 мкм, отже, роздільна здатність ультрафіолетового мікроскопа 0,1 мкм, але так як ультрафіолетове випромінювання є невидимим, то для спостереження об'єкта, що досліджується, необхідний люмінесцентний екран.
Флюоресцентна (люмінесцентна) мікроскопія. Короткохвильове (невидиме) випромінювання, поглинаючись рядом речовин, збуджує їх електрони, які випромінюють світло з більшою довжиною хвилі, стаючи видимою частиною спектра. Таким чином, домагаються підвищення роздільної здатності мікроскопа.
Фазовоконтрастна мікроскопія дозволяє випромінювати незабарвлені об'єкти.
Поляризаційна мікроскопія застосовується вивчення архітектоніки гістологічних структур, наприклад, колагенового волокна.
Електронна мікроскопія дає можливість вивчати об'єкти, збільшені в десятки тисяч разів.
Мікрофотозйомка та мікрокінозйомка . Ці методи дозволяють вивчати фіксовані об'єкти на фотографіях та живі мікроскопічні об'єкти у русі.
Гісто –та цитохімія , у тому числі кількісна, дозволяє проводити якісний аналіз досліджуваних об'єктів на тканинному, клітинному та субклітинному рівнях.
Цитоспектрофотометрія Дає можливість вивчати кількісний вміст тих чи інших біологічних речовин у клітинах та тканинах на основі поглинання світла певної довжини хвилі пов'язаним ними барвником.
Диференційне центрифугування дозволяє розділяти вміст клітин, що відрізняються між собою своєю масою.
Радіографія Заснована на включенні радіоактивної мітки (наприклад, радіоактивного йоду, Н-тимідину та ін) в обмінний процес.
Морфометрія дозволяє проводити вимірювання площ та об'ємів клітин, їх ядер та органел за допомогою окуляр- та об'єкт-мікрометрів та спеціальних сіток.
Застосування ЕОМ для автоматичного оброблення цифрового матеріалу.
Метод культури тканинє підтримкою життєздатності і поділу клітин і тканин поза організмом. Для цього використовують спеціальні контейнери з живильним середовищем, у яких створюються всі необхідні умови для життєдіяльності клітин. За допомогою цього методу можна вивчати диференціювання та функціональне становлення клітин, закономірності їх злоякісного переродження та розвитку пухлинного процесу, міжклітинну взаємодію, ураження клітин та тканин вірусами та мікроорганізмами, вплив лікарських препаратівна обмінні процеси у клітинах і тканинах тощо.
Прижиттєве (вітальне) фарбування використовується для вивчення явищ фагоцитозу та активності макрофагів, фільтраційної здатності ниркових канальців та ін.
Метод трансплантації тканин. Цей метод застосовують з метою вивчення поведінки клітин та їх морфофункціонального стану при їх пересадці в інший організм. Наприклад, цей спосіб використовується підтримки життя тварин, схильних до опромінення смертельної дозою.
Мікроманіпуляція.Даний метод отримав застосування молекулярної біології, генної інженерії, а також при клонуванні, коли за допомогою мікроманіпулятора видаляють ядро з яйцеклітини з гаплоїдним набором хромосом і пересаджують в неї ядро соматичної клітини з диплоїдним набором хромосом.
Предмет гістології. Методи гістологічних досліджень. Клітинна теорія.
ВСТУП У ГІСТОЛОГІЮ. БУДОВА КЛІТИНИ.
Лекція 1
Гістологія– це наука про будову, розвиток та життєдіяльність тканин матерії. Тканини вивчають у живому та неживому стані. Вивчення гістологічних об'єктів, їх найтоншої структури проводять з допомогою мікроскопів, які збільшують невидимі простим оком деталі будівлі кілька сотень тисяч разів.
Курс гістології умовно поділено на такі розділи:
1. Цитологія – наука про клітину.
2. Ембріологія – наука про розвиток, від зародження до повного формування організму.
3. Загальна гістологія – наука про загальні закономірності, властиві тканинам.
4. Приватна гістологія - наука про будову, розвиток органів та систем.
Головним завданням гістології як предмета є отримання знань про мікроскопічну та ультрамікроскопічну будову клітин, тканин органів та систем здорового організму, у нерозривному зв'язку з їх розвитком та виконуваними функціями.
Основними методами гістологічних досліджень є мікроскопування та спеціальні (немікроскопічні) методи (гістохімія, цитофотометрія, авторадіографія та ін.).
Об'єктами дослідження можуть бути живі чи мертві (фіксовані) клітини та тканини.
Для вивчення клітин та тканин під мікроскопом виготовляють гістологічні препарати.
Основними методами дослідження гістологічних об'єктів є світлова та електронна мікроскопія, які широко використовуються у клінічній та експериментальній практиці.
Світлооптичні мікроскопи.Основна оптична частина мікроскопа складається з об'єктиву та окуляра. Об'єктив є найбільш відповідальною оптичною системою, що дає збільшене зображення предмета. Окуляр - оптична система, яка служить як лупа при візуальному спостереженні збільшеного зображення предмета, що дається об'єктивом. Окуляр зазвичай збільшує зображення у 5-25 разів.
Так само найважливішими характеристиками мікроскопа є роздільна здатність та збільшення. Роздільна здатність - мінімальна відстань між двома точками об'єкта, які видно окремо. Збільшення мікроскопа- величина, що показує, скільки разів лінійні розміри зображення, формованого оптичної системою мікроскопа, більше лінійних розмірів об'єкта. Збільшення мікроскопа залежить від збільшення об'єктиву і окуляра і чисельно дорівнює добутку цих збільшення. Сучасні оптичні мікроскопи мають межу корисного збільшення до 1500 разів.
Електронна мікроскопіяЕлектронні мікроскопи мають високу роздільну здатність. Іншими словами, в електронному мікроскопі теоретично можливе підвищення роздільної здатності і відповідно збільшення зображення в 150000 разів більше у порівнянні зі світловим мікроскопом. Найчастіше в морфологічних дослідженнях використовуються електронні мікроскопи, що просвічують, що дозволяють отримати площинне зображення досліджуваного об'єкта. В останні роки активно застосовуються растрові (скануючі) електронні мікроскопи, здатні створювати тривимірні зображення, тобто одержувати просторове зображення структур.
Методи кількісного дослідження мікроструктур у гістологічних та цитологічних препаратах. Кількісна оцінка мікроструктур є необхідною умовою отримання об'єктивних даних про їх стан у нормі, при експериментальних впливах та у патології. Основними кількісними показниками мікроструктур є морфометричні (кількість структур та їх геометричні параметри) і денситометричні, що відображають концентрацію (оптичну щільність) хімічних речовину мікроструктурах. Для виявлення цих параметрів застосовують морфометричні та спектрофотометричні методи, а також автоматизовані системи обробки зображень.
Вивчення організму на тканинному та клітинному рівнях вимагає приготування гістологічних препаратів та їх розгляду під мікроскопом. Мета приготування гістологічного препарату полягає в тому, щоб шляхом обробки привести досліджуваний матеріал у зручний для вивчення під мікроскопом стан, зробити його прозорим та контрастним.
Часто вивчення матеріалу у свіжому вигляді є найбільш доцільним (наприклад, спостереження за роботою вій миготливого епітелію). Для виготовлення препарату береться чисте предметне скло. На його середину міститься крапля води або фізіологічного розчину, в яку занурюють шматочки тканини, що підлягає розгляду, і під контролем мікроскопа розправляють їх голками препаровальними.
Щоб зробити препарат більш контрастним і отримати можливість добре розрізняти окремі його деталі, об'єкт піддають фарбуванню. При цьому користуються тим, що різні структури тканин і клітин по-різному реагують на той чи інший барвник.
Виготовлення постійних препаратів вимагає досить великої витрати важкий час, такі препарати можна використовувати протягом багатьох років. Препарати готують із невеликих цілих об'єктів (тотальні препарати) або зрізів; За всіх умов об'єкт чи зріз має бути тонким та прозорим, інакше неможливе його вивчення під мікроскопом.
Виготовлення препарату складається з кількох етапів.
2. Об'єкти дослідження гістології
3. Приготування гістологічних препаратів
4. Методи дослідження
5. Історичні етапи розвитку гістології
1. Гістологіянаука про мікроскопічну та субмікроскопічну будову, розвиток та життєдіяльність тканин тварин організмів. Отже, гістологія вивчає один із рівнів організації живої тканинної тканини. Розрізняють такі ієрархічні рівніорганізації живої матерії:
клітинний;
тканинний;
структурно-функціональні одиниці органів;
органний рівень;
системний рівень;
організмовий рівень
Гістологія як навчальна дисципліна, включає наступні розділи: цитологію, ембріологію, загальну гістологію (вивчає будову та функції тканин), приватну гістологію (вивчає мікроскопічну будову органів).
Основним об'єктомВивчення гістології є організм здорової людини і тому дана навчальна дисципліна називається як гістологія людини.
Основна задачагістології полягає у вивченні будови клітин, тканин, органів, встановлення зв'язків між різними явищами, встановлення загальних закономірностей.
Гістологія, як і анатомія, відноситься до морфологічних наук, головним завданнямяких вивчення структур живих систем. На відміну від анатомії, гістологія вивчає будову живої матерії на мікроскопічному та електронно-мікроскопічному рівні. При цьому вивчення будови різних структурних елементів проводиться в даний час з урахуванням виконуваних ними функцій. Такий підхід до вивчення структур живої матерії називається гістофізіологічним, а гістологія нерідко називається як гістофізіологія.Крім того, при вивченні живої матерії на клітинному, тканинному і органному рівнях розглядається не тільки форма, розміри і розташування структур, що цікавлять, але методом цито-і гістохімії нерідко визначається і склад речовин, що утворюють ці структури. Нарешті, структури, що вивчаються, зазвичай розглядаються з урахуванням їх розвитку, як у внутрішньоутробному (ембріональному) періоді, так і протягом постембріонального онтогенезу. Саме з цим пов'язана необхідність включення ембріології до курсу гістології.
Гістологія, як будь-яка наука, має свої об'єкти та методиїх вивчення. Безпосередніми об'єктами вивчення є клітини, фрагменти тканин та органів, особливим способом приготовані для вивчення під мікроскопом.
2. Об'єкти дослідженняподіляються на:
живі (клітини у краплі крові, клітини у культурі та інші);
мертві або фіксовані, які можуть бути взяті від живого організму (біопсія), так і від трупів.
У будь-якому випадку після взяття шматочків вони піддаються дії фіксуючих розчинів або заморожування. І в наукових, і навчальних цілях використовуються фіксовані об'єкти. Приготовлені певним способом препарати, що використовуються для вивчення мікроскопом, називаються гістологічними препаратами.
Гістологічний препаратможе бути у вигляді:
тонкого забарвленого зрізу органу чи тканини;
мазка на склі;
відбитка на склі з розлому органу;
тонкого плівкового препарату.
Гістологічний препарат будь-якої форми повинен відповідати таким вимогам:
зберігати прижиттєвий стан структур;
бути досить тонким і прозорим для вивчення його під мікроскопом у світлі, що проходить;
бути контрастним, тобто структури, що вивчаються, повинні під мікроскопом чітко визначатися;
препарати для світлової мікроскопії повинні довго зберігатися та використовуватися для повторного вивчення.
Ці вимоги досягаються під час приготування препарату.
3. Виділяють такі етапи приготування гістологічного препарату
Взяття матеріалу(Шматочка тканини або органу) для приготування препарату. При цьому враховуються наступні моменти: забір матеріалу повинен проводитися якомога раніше після смерті або вибою тварини, а при можливості від живого об'єкта (біопсія), щоб краще збереглися структури клітини, тканини або органу; паркан шматочків повинен проводитися гострим інструментом, щоб не травмувати тканини; товщина шматочка не повинна перевищувати 5 мм, щоб фіксуючий розчин міг проникнути в товщу шматочка; обов'язково проводиться маркування шматочка (вказується найменування органу, номер тварини або прізвище людини, дата забору тощо).
Фіксація матеріалунеобхідна для зупинення обмінних процесів та збереження структур від розпаду. Фіксація досягається найчастіше зануренням шматочка в фіксуючі рідини, які можуть бути простими спиртами і формалінами і складними розчинами Карнуа, фіксатором Цинкера та іншими. Фіксатор викликає денатурацію білка і тим самим зупиняє обмінні процеси та зберігає структури у їхньому прижиттєвому стані. Фіксація може досягатися також заморожуванням (охолодженням у струмені СО2, рідким азотом та інші). Тривалість фіксації підбирається дослідним шляхом кожної тканини чи органа.
Заливання шматочків у ущільнюючі середовища(парафін, целоідин, смоли) або заморожування для подальшого виготовлення тонких зрізів.
Приготування зрізівна спеціальних приладах (мікротом або ультрамікротом) за допомогою спеціальних ножів. Зрізи для світлової мікроскопії приклеюються на предметне скло, а для електронної мікроскопії - монтуються на спеціальні сіточки.
Забарвлення зрізівабо їхнє контрастування (для електронної мікроскопії). Перед забарвленням зрізів видаляється ущільнююче середовище (депарафінізація). Забарвленням досягається контрастність досліджуваних структур. Барвники поділяються на основні, кислі та нейтральні. Найбільш широко використовуються основні барвники (зазвичай гематоксилін) та кислі (еозин). Нерідко використовують складні барвники.
Просвітлення зрізів(у ксилолі, толуолі), укладання в смоли (бальзам, полістерол), закриття покривним склом.
Після цих послідовно проведених процедур препарат може вивчати під світловим мікроскопом.
Для цілей електронної мікроскопіїв етапах приготування препаратів є деякі особливості, але загальні принципи самі. Головна відмінність полягає в тому, що гістологічний препарат для світлової мікроскопії може тривалий час зберігатися і багаторазово використовуватися. Зрізи для електронної мікроскопії використовуються одноразово. При цьому спочатку об'єкти препарату, що цікавлять, фотографуються, а вивчення структур проводиться вже на електронограмах.
З тканин рідкої консистенції(Кров, кістковий мозок та інші) виготовляються препарати у вигляді мазка на предметному склі, які також фіксуються, фарбуються, а потім вивчаються.
Зі ламких паренхіматозних органів(печінка, нирка та інші) виготовляються препарати у вигляді відбитка органу: після розлому або розриву органу, до місця розлому органу прикладається предметне скло, на яке приклеюються деякі вільні клітини. Потім препарат фіксується, фарбується та вивчається.
Зрештою, з деяких органів(брижа, м'яка мозкова оболонка) або з пухкої волокнистої сполучної тканини виготовляються плівкові препарати шляхом розтягування або роздавлювання між двома стеклами, також з наступною фіксацією, забарвленням та заливкою в смоли.
4. Основним методом дослідженнябіологічних об'єктів, що використовуються в гістології є мікроскопування, Т. е. вивчення гістологічних препаратів за мікроскопом. Мікроскопія може бути самостійним методом вивчення, але останнім часом вона зазвичай поєднується з іншими методами (гістохімії, гісторадіографії та інші). Слід пам'ятати, що для мікроскопії використовуються різні конструкції мікроскопів, що дозволяють вивчити різні параметри об'єктів, що вивчаються. Розрізняють такі види мікроскопії:
світлова мікроскопія (роздільна здатність 0,2 мкм) найбільш поширений вид мікроскопії;
ультрафіолетова мікроскопія (роздільна здатність 0,1 мкм);
люмінесцентна (флюоресцентна) мікроскопія для визначення хімічних речовин у структурах, що розглядаються;
фазово-контрастна мікроскопія для вивчення структур у незабарвлених гістологічних препаратів;
поляризаційна мікроскопія для вивчення, головним чином, волокнистих структур;
мікроскопія у темному полі для вивчення живих об'єктів;
мікроскопія в падаючому світлі вивчення товстих об'єктів;
електронна мікроскопія (роздільна здатність до 0,1-0,7 нм), два її різновиди просвічує (трансмісійна) електронна мікроскопія і скануюча або растрова мікроскопії дає відображення поверхні ультраструктур.
Гістохімічні та цитохімічні методидозволяє визначати склад хімічних речовин і навіть їх кількість у структурах, що вивчаються. Метод заснований на проведенні хімічних реакцій з реактивом і хімічними речовинами, що знаходяться в субстраті, з утворенням продукту реакції (контрастного або флюоресцентного), який потім визначається при світловій або люмінесцентній мікроскопії.
Метод гістоавторадіографіїдозволяє виявити склад хімічних речовин у структурах та інтенсивність обміну по включенню радіоактивних ізотопів до досліджуваних структур. Метод найчастіше використовується в експериментах на тваринах.
Метод диференціального центрифугуваннядозволяє вивчати окремі органели чи навіть фрагменти, виділені із клітини. Для цього шматочок досліджуваного органу розтирають, заливають фізіологічним розчином, а потім розганяють в центрифузі при різних обертах (від 2-х до 150 тис.) і отримують фракції, що цікавлять, які потім вивчають різними методами.
Метод інтерферометріїдозволяє визначити суху масу речовин у живих чи фіксованих об'єктах.
Імуноморфологічні методидозволяє за допомогою попередньо проведених імунних реакцій, на підставі взаємодії антиген-антитіло, визначати субпопуляції лімфоцитів, визначати ступінь чужорідності клітин, проводити гістологічне типування тканин та органів (визначати гістосумісність) для трансплантації органів.
Метод культури клітин(in vitro, in vivo) вирощування клітин у пробірці або в особливих капсулах в організмі та подальше вивчення живих клітин під мікроскопом.
Одиниці виміру, що використовуються в гістології
Для вимірювання структур у світловій мікроскопії використовуються переважно мікрометри: 1 мкм становить 0,001 мм; в електронній мікроскопії використовують нанометри: 1 нм становить 0,001 мкм.
5. У історії розвитку гістологіїумовно виділяють триперіоду:
Домікроскопічний період(з IV ст. до н. е. по 1665 р.) пов'язаний з іменами Аристотеля, Галена, Авіценни, Везалія, Фалопія і характеризується спробами виділення в організмі тварин і людини неоднорідних тканин (твердих, м'яких, рідких тощо) та використанням методів анатомічного препарування
Мікроскопічний період(З 1665 по 1950). Початок періоду пов'язують з ім'ям англійського фізика Роберта Гука, який, по-перше, удосконалив мікроскоп (вважають, що перші мікроскопи були винайдені на початку XVII ст.), по-друге, використав його для систематичного дослідження різних, у тому числі біологічних об'єктів і опублікував результати цих спостережень у 1665 р. у книзі "Мікрографія", по-третє, вперше ввів термін "клітина" ("целюля"). Надалі здійснювалося безперервне вдосконалення мікроскопів і дедалі ширше використання їх вивчення біологічних тканин і органів.
Особлива увага приділялася вивченню будови клітини. Ян Пуркіньє описав наявність у тварин клітинах "протоплазми" (цитоплазми) і ядра, а пізніше Р. Броун підтвердив наявність ядра і в більшості тварин клітин. Ботанік М. Шлейден зацікавився походженням клітин цитокенезисом. Результати цих досліджень дозволили Т. Швану на підставі їх повідомлень сформулювати клітинну теорію (1838-1839 рр.) у вигляді трьох постулатів:
всі рослинні та тваринні організми складаються з клітин;
всі клітини розвиваються за загальним принципом із цитобластеми;
кожна клітина має самостійну життєдіяльність, а життєдіяльність організму є сумою діяльності клітин.
Однак невдовзі Р. Вірхов (1858 р.) уточнив, що розвиток клітин здійснюється шляхом поділу вихідної клітини (будь-яка клітина з клітини). Розроблені Т. Шваном положення, клітинної теорії актуальні до нашого часу, хоча формулюється інакше.
Сучасні положення клітинної теорії:
клітка є найменшою одиницею живого;
клітини тварин організмів подібні за своєю будовою;
розмноження клітин відбувається шляхом поділу вихідної клітини;
Багатоклітинні організми являють собою складні ансамблі клітин та їх похідних, об'єднані в системи тканин та органів, пов'язані між собою клітинними, гуморальними та нервовими формами регуляції.
Подальше вдосконалення мікроскопів, особливо створення ахроматичних об'єктивів, дозволило виявити у клітинах дрібніші структури:
клітинний центр Гертвіг, 1875;
сітчастий апарат або пластинчастий комплекс Гольджі, 1898;
мітохондрії Бенда, 1898 р.
Сучасний етапрозвитку гістології починається з 1950 р. з початку використання електронного мікроскопа вивчення біологічних об'єктів, хоча електронний мікроскоп було винайдено раніше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 р.). Однак для сучасного етапу розвитку гістології характерне впровадження не тільки електронного мікроскопа, але й інших методів: цито- та гістохімії, гісторадіографії та інших перерахованих вище сучасних методів. При цьому зазвичай використовується комплекс різноманітних методик, що дозволяє скласти не тільки якісне уявлення про структури, що вивчаються, але і отримати точні кількісні характеристики. Особливо широко нині використовуються різні морфометричні методики, зокрема автоматизовані системи обробки отриманої інформації з допомогою комп'ютерів.
Лекція 2. Цитологія. Цитоплазма
Об'єктами дослідження можуть бути фіксовані (мертві) чи живі клітини і тканини.
Для дослідження мікроструктури сировини та продуктів тваринництва, як правило, використовують фіксовані клітини та тканини. Препарати бувають тимчасовими, призначеними для одноразового вивчення, та постійними, які можна зберігати та багаторазово досліджувати. Крім того, використовують тотальні чи цілісні препарати.
Тимчасові препаратиможна приготувати порівняно швидко; для цього досліджуваний матеріал фіксують і отримують зрізи на мікротомі, що заморожує, при його відсутності можна зробити тоненький зріз тканини або органу скальпелем або лезом. Отриманий зріз фарбують, поміщають на предметне скло, потім наносять краплю гліцерину і накривають покривним склом. Для виявлення крохмалю використовують розчин йоду в йодистому калії: у невеликій кількості води розчиняють 0,5 г йодистого калію, вносять 1 г кристалічного йоду та додають води до 100 см 3 . На тоненький шматочок ковбаси, сиру та іншого матеріалу, розташований на предметному склі, наносять кілька крапель реактиву, крохмаль забарвлюється у синьо-фіолетовий колір.
Тотальні або цілісні препаратидосліджують без отримання зрізу тканини чи органа. Наприклад, плівку підшкірної клітковини або роздавлений препарат корінця рослин після фіксації, промивання та фарбування укладають між предметним та покривним склом. Для виявлення окремих структурних елементів фіксовані та забарвлені шматочки підшкірної клітковини або гладкої м'язової тканини розщипують голкою на предметному склі – такі препарати називають розщипаними. У ряді випадків, наприклад, досліджуючи плівку сітківки очного яблука або шкіру пуголовка, після фіксації та промивки забарвлення не роблять, тому що в клітинах є органічні включення (пігмент), що мають природне забарвлення.
Методика підготовки гістологічного препаратуОсновним способом вивчення фіксованих клітин і тканин є гістологічний, тобто. дослідження забарвленого зрізу тканини, укладеного у спеціальне середовище. Для отримання зрізів використовують заливку досліджуваного матеріалу в парафін або целоідин, що дозволяє отримувати тонкі зрізи (5-7 мкм або 10-30 мкм відповідно), для швидкого приготування зрізів (40-60 мкм) використовують техніку, що заморожує.
Основні етапи підготовки гістологічного препарату: відбір проб, фіксація, промивання, зневоднення, заливання до парафіну або целоїдину, фарбування, укладання під покривне скло.
Відбір пробпроводиться з урахуванням мети дослідження та структури матеріалу. Розмір проби повинен у середньому не перевищувати 2,5-3,0 см. Проби печінки, селезінки беруть із капсулою. Із серця вирізують шматочки передсердя, оскільки оболонки тонші, ніж у шлуночках та на одному препараті можна бачити топографічне відношення епікарда, міокарда та ендокарда. З нирок, лімфатичних вузлів, надниркових залоз вирізують ділянки органів, що йдуть углиб перпендикулярно поверхні так, щоб на препараті виявлялися кіркова та мозкова речовина. При необхідності приготувати препарати змінених органів шматочки досліджуваного матеріалу вирізають на кордоні з ураженою ділянкою, щоб у пробу потрапила зона переходу вогнища. Зі скелетної мускулатури проби слід вирізати так, щоб м'язові волокна були в поздовжньому і поперечному перерізі. Проби зразків фаршу, сиру та інших зразків, що розсипаються, попередньо поміщають у шматочок марлі і перев'язують ниткою. Слід враховувати, що при розтині грудної порожнини легені внаслідок еластичності спадаються, значно втрачаючи легкість, тому в трахею видобутих дихальних органів вставляють скляну або гумову трубку, через яку помірно вводять повітря. На трахею нижче за вставлену трубку накладають шовкову лігатуру, для повного занурення прив'язують вантаж. Для фіксації кишечника попередньо перев'язують лігатурами із двох сторін ділянку органу, призначеного для фіксації. Проби постачають етикетками із щільного паперу з позначенням номера та дати відбору проби.
Фіксація,тобто. збереження природної (прижиттєвої) архітектоніки, що проводиться з метою перевести живу протоплазму структур у незмінний стан. Дія фіксаторів проявляється в тому, що в тканинах та органах внаслідок біофізичних процесів відбувається незворотня коагуляція білків. Взятий з органу зразок тканини якнайшвидше занурюють у фіксатор; співвідношення обсягу матеріалу та фіксуючої рідини має бути не менше 1:9 (рис. 3).
Фіксація призводить до деякого ущільнення та зменшення обсягу зразка. Найчастіше для фіксації використовують 10-12%-ний формалін, етиловий спирт, ацетон. Для приготування зазначеної концентрації фіксуючої рідини 40%-ний формалін розбавляють водопровідною водою. Етиловий спирт (100%-ний абсолютний, або 96%-ний) застосовують у тих випадках, коли потрібно у зрізах виявити речовини, що розчиняються у водних фіксаторах (наприклад, глікоген). В ацетоні досліджуваний матеріал (наприклад, головний мозок) фіксують лише кілька годин. Коли досліджуваний орган, наприклад кісткової тканини, містить вапно, проводиться декальцинація або звапніння. Для цього невеликий шматочок кістки опускають (краще підвісити на нитці) у 5-8%-ний водний розчин азотної кислоти, який за добу міняють 2-3 рази Про результат декальцинації судять, вколюючи тонку голку в кістку: якщо немає опору – декальцинація закінчена. Після такої про-
Промивкапроводиться для видалення зайвої кількості фіксатора, наприклад, після фіксації формаліном промивання проводять проточною водопровідною водою.
Зневодненняпроводять для ущільнення матеріалу в етиловому спирті висхідної концентрації: 50-70-100. Для приготування 50%-ного та 70%-ного спирту 96%-ний спирт розбавляють дистильованою водою. Щоб приготувати 100% спирт, необхідно мідний купорос розжарити до повного зневоднення і в зневоднений порошок білого кольору додати 96% етиловий спирт. У кожній концентрації спирту матеріал тримають 1-24 години залежно від величини шматочків, будови органу; у 70%-ному спирті матеріал можна тримати протягом кількох діб.
Заливанняпроводиться таким середовищем, щоб досліджуваний зразок став твердим, що дозволяє одержувати тонкі зрізи. Для цього використовують парафін (просочення 1-4 год), целоїдин (просочення три тижні). При виявленні жирів та для дослідження пухких тканин та органів використовують заливання у желатин.
Зрізиодержують на санних або ротаційних мікротомах. Найбільш тонкі зрізи (5-7 мкм) вдається виготовити з матеріалу, залитого парафін. З матеріалу, залитого целоїдином, готують зрізи завтовшки 15-20 мкм. Для дослідження мікроструктури сировини та продуктів тваринного походження, як правило, використовують заморожуючу техніку. Це прискорює виготовлення препарату, оскільки виключаються тривалі етапи зневоднення та заливання. Після фіксації та промивання шматочки об'єкта поміщають на вологий предметний столик мікротома, що заморожує, і отримують зрізи товщиною 40-60 мкм. Зрізи переносять пензликом у воду, де вони розправляються, набуваючи вигляду найтонших сірих клаптиків.
Фарбування зрізівпроводять збільшення контрастності різних структур у препаратах, призначених на дослідження у світловому мікроскопі. У процесі фарбування відбуваються складні хімічні та фізичні процеси, тому при виборі методу враховують вибіркову спорідненість структур клітини до певних барвників з різними фізико-хімічними властивостями.
Розрізняють барвники основні (базальні), кислі та спеціальні. Структури, що фарбуються основними барвниками, називаються базофільними,кислими барвниками - оксифільними, ацидофільними, еозинофільними.
З основних (базальних) барвників використовують гематоксилін, що фарбує хроматин ядра та інші структури, що містять білок, синій або фіолетовий колір; кармін, що фарбує ядро у світло-червоний колір, сафранін – темно-червона фарба, тіонін – синя фарба.
З кислих барвників застосовують еозин (забарвлює цитоплазму в рожевий колір), пікринову кислоту (жовтий колір), фуксин (цегляний колір), кармін індиго (синій колір).
При дослідженні мікроструктури сировини та продуктів тваринництва найчастіше використовується комбіноване забарвлення гематоксиліном та еозином. Для цього зрізи з води на 1-3 хв переносять у розчин гематоксиліну; 20-30 хв промивають у воді, на 3-5 хв поміщають у розчин еозину і 3-5 хв промивають водою. Воду, що залишилася, видаляють фільтрувальним папером, наносять краплю 96%-ного етилового спирту на 1-2 хв, зневоднюють в 25%-ному розчині карболової кислоти в ксилолі або толуолі. Потім на зріз наносять 1-2 краплі бальзаму та закривають покривним склом.
З барвників, що фарбують жирові включення часто використовують судан 111. Для приготування розчину барвника в 95 см 3 85% етилового спирту додають 5 см 3 ацетону і насипають порошок Судану III до отримання насиченого розчину (барвник повинен утримуватися надлишку). Суміш нагрівають до 50% і фільтрують. Зрізи, отримані на заморожуючому мікротомі, поміщають у 50%-ний етиловий спирт на 1-2 хв, а потім у судан III на 25 хв. Зрізи обполіскують у 50%-ному спирті, промивають дистильованою водою і укладають у гліцерин-желатин.
Краплі нейтрального жиру забарвлюються в оранжевий колір за рахунок розчинення Судану III у жирах. Виявити жирові включення можна також осмієвою кислотою, причому жирові структури забарвлюються в чорний колір.
Висновок під покривне склопроводять у середовища, що не пропускають повітря і здатні довго зберігати зріз. Забарвлені зрізи зневоднюють у спиртах зростаючої міцності і укладають під покривне скло в ялицевий, канадський бальзам або гліцерин-желатин (препарат не повинен стикатися зі спиртами та ксилолом).
Підготовка препаратів до електронної мікроскопії.Для дослідження біологічних об'єктів використовують два види електронних мікроскопів: просвічуючий (трансмісійний) та скануючий (растровий).
Принцип обробки об'єкта для дослідження в електронному мікроскопі, що просвічує, заснований на тих же положеннях, що і для оптичних мікроскопів: відбір проб, фіксація, промивання, зневоднення, заливка, приготування ультратонких зрізів, контрастування.
Відбір пробпроводиться з урахуванням мети дослідження та структури матеріалу, з дотриманням тих самих правил, що й для світлової мікроскопії. Об'єм шматочків досліджуваного матеріалу не повинен перевищувати 1 мм3. Головна мета фіксації - зберегти тканину якомога ближче до прижиттєвого стану.
Фіксаціяпроводиться для кращого збереження структур, тому необхідно застосовувати реактиви, що мають певні pH і ізотонічність, величини яких визначаються видом тканини, що фіксується. Процес фіксації проводиться у два етапи: префіксація та постфіксація. Для префіксації застосовують розчин 2,5-3%-ного розчину глютарового альдегіду (pH 7,2-7,4), тривалість фіксації 2-4 год. Постфіксацію здійснюють у 2%-ному розчині (pH 7,2-7,4) ) - 1-2 год. Для збереження прижиттєвої структури рекомендується використовувати фіксатор низької температури (0-4 °С), і готувати фіксатори на фосфатно-буферних, какодилатних, віро-нал-ацетатних розчинах.
Промивкапроводиться 30%-ним холодним спиртом 5-7 разів, кожної порції спирту витримують об'єкт протягом 30 хв, тобто. відмивають від фіксатора до такого стану, коли припиняються окислювальна дія фіксатора.
Зневодненняпроводять етиловими спиртами зростаючої міцності: 30, 50, 70, 96, 100% по 30 хв. При деяких методах заливки для зневоднення рекомендується додатково використовувати ацетон та пропіленоксид.
Заливанняпроводиться в епоксидні смоли(аралдит, епон та ін.). Полімеризацію смол у капсулах проводять у термостаті при 60 °С до затвердіння, як правило, протягом 1-2 діб.
Ультратонкі зрізиодержують за допомогою скляних ножів на ультрамікротомі, для цього епоксидні блоки заточують у формі чотиригранної усіченої піраміди. Серійні зрізи сірого кольору надходять у ванну з 10%-ним етиловим спиртом. Отримані зрізи монтують на мідні або сідочки паладієві, на поверхню яких попередньо наносять плівку з формвара. Для виявлення необхідних структур зрізи на сіточках обробляють розчинами цитрату свинцю та уранілацетату.
Для скануючої електронної мікроскопіїдосліджуваний зразок фіксують, зневоднюють залежно від мети дослідження, використовуючи вказані вище фіксатори. Після зневоднення зразок приклеюють на об'єкт-тримач, поміщають в установку напилки і покривають найтоншим шаром золота або платини. На відміну від електронної мікроскопії, що просвічує, для скануючої можна використовувати корозійні препарати: об'єкт вивчення заливають якими-небудь твердіють речовинами і після цього переглядають зліпки і поверхні. Вивчають також репліки, які отримують шляхом заморожування - сколювання. В цьому випадку досліджують зліпок сколу поверхні об'єкта. Щоб збільшити контраст, репліки необхідно відтінити за допомогою напилення частинок металів (золота, платини) або вугілля.
Контрольні питання
