Metode histološkog istraživanja. Današnja histologija ima širok arsenal različitih metoda istraživanja. Sve ove metode se oslanjaju na upotrebu posebnog uređaja - mikroskopa, te su stoga sve mikroskopske metode.
Pažljivo ću početi da istražujem predmet koji se istražuje, a ove metode će se podijeliti na vitalne (ili supravitalne), ako su uključene žive ćelije, tkiva, organi i cijeli organizmi, i post-vitalne, ako istražuju mrtve fiksne i objekte. .
Razvoj post-vitalne metode, odnosno metode pripreme trajnog histološkog preparata, odvijao se paralelno sa razvojem histološke nauke u drugoj polovini 19. stoljeća. Ovo se također naziva metodom klasične histologije. Ova metoda, koja se naziva histološka ili mikroskopska tehnika, zahtijeva potpunu pripremu predmeta istraživanja. Ostaje predmet posebnog pisanja, do velikih obveznika. Student koji počinje studirati histologiju mora se upoznati sa osnovnim tehnikama za pripremu histoloških preparata kako bi bolje razumio preparate i naučio analizirati, „čitati“, pa čak i najnovije histološke preparate, a lijekovi se široko koriste u početnom procesu iu naučnom istraživanju.
Prva faza u pripremi lijeka je uklanjanje materijala. Nakon ove faze, kao i kod svih napada, slijedi završetak posljednje povrede objekta. Stoga, kada pravite rezove na organu ili tkivu, morate koristiti oštre noževe i oštrice i nemojte stiskati tkaninu pincetom. Komadi se uzimaju u malim veličinama - oko 1 cm3 (više od 7x7x3 mm). Materijal mora biti svjež i mora se uzeti što je prije moguće nakon smrti eksperimentalnog bića ili smrti osobe.
Sljedeća faza je fiksiranje materijala, što uključuje zatezanje preuzetog boda i fiksiranje rubova. Svrha ove faze je konsolidacija histoloških struktura i makromolekula na mjestu gdje je miris bio u živom objektu. Prije svega, fiksativi minimiziraju promjene u uspostavljenim strukturama, ili možete odabrati posebna sredstva za fiksiranje kako biste te promjene sveli na minimum. Fiksativi uključuju alkohole (etilni alkohol, metil alkohol), derivate formalina, važne soli metala i kiseline (oktolna kiselina, pikrinska kiselina, osmička kiselina). Najčešće postoje razne sklopive vrećice za fiksiranje koje uključuju nazive komponenti različitih spojeva.
Treća faza je zalijevanje fiksnog materijala. U tu svrhu koriste se alkoholi različitih koncentracija, tako da se postepeno povećavaju od 50-70 do 100 stepeni. Hidroizolacija je neophodna u sljedećoj fazi - ojačani objekt koji se nalazi u parafinu, celulozi i sintetičkim smolama. Važno je da se većina ovih smola ne miješa s vodom, te je stoga, da bi prodrle u materijal, potrebno pažljivo ukloniti vodu iz tkanine, a zatim je natopiti ksilenom (toluenom, benzolom), ili smolu, koja dobro razgrađuje parafin, kao i pomešati sa 100-stepenim etil alkoholom. Nakon infiltracije predmeta rijetkim parafinom na temperaturi od 55-5°C, ostavlja se da se stvrdne na sobnoj temperaturi zajedno sa parafinom u posebnim oblicima. Ovako se kontroliše parafinski blok. Ovaj postupak se zove punjenje. Postoji brži način zamrzavanja ostataka tkanine suhim ledom (ugljičnim dioksidom) ili rijetki azot, struktura proučavanih histoloških objekata je očuvana u različito vrijeme.
Ojačani materijal omogućava proizvodnju tankih (5-7 µm debljine), tankih (0,5-1 µm) preseka koji se mogu vikorizirati za svjetlosnu mikroskopiju i ultratankih vikoriziranih za elektronsku mikroskopiju i vid (0,05-0,2 µm). Priprema preseka se vrši na specijalnim mikrotomskim uređajima (za svetlosnu mikroskopiju) i ultramikrotomskim uređajima (za elektronsku mikroskopiju). Tanke, tanke ili ultra tanke sekcije su jasne za izmjenu svjetlosti ili snopove elektrona sa objektima i omogućavaju im da se pregledaju pod mikroskopima visokog kvaliteta. Da bi se secirali strukturni detalji objekta, od kojih većina nema prirodne dimenzije, potrebno ih je razdvojiti kroz potrebu pripreme (za snimanje pod svjetlosnim mikroskopom) ili kontrastiranja (za elektronski mikroskop).
Histologija ima različite metode za pripremu preparata i kompostiranje raznih vrsta žutika, koje se moraju pridržavati. Histološki, žutika se dijeli na divlju, divlju i sintetičku (anilin). Plod bobica je hematoksilin, koji se ekstrahuje iz kore drveta brvnara, koje raste u Srednjoj Americi, i supstanca koja se nalazi u komarcima - som. Apsolutna većina žutika je sintetička - eozin, fuksin, azur itd.
Najvažnija stvar je klasifikacija histoloških žutika za hemijske vlasti, tako da na njemu postoji niz pojmova koji će tokom kursa postati jasniji. Stoga, prema hemijskim autoritetima, histološke žutike se dijele na kisele, bazične i neutralne. Svojstva kisele žutike klasifikuju se u grupe -COOH, -HS03, H2P03, koje se nazivaju anjonske žutike. Kisele bobice sadrže citoplazmu celulita, zovu se citoplazmatska. Stražnjica takvih bobica može biti eozin (daje svijetlu crvenkastu boju), svijetlo zelena (daje zelene boje). Histološke strukture koje se pripremaju kiselim bobicama zovu se oksifilne (acidofilne, eozinofilne). To su, na primjer, citoplazmatske granule eozinofilnih leukocita, kolagena vlakna itd.
Glavni spojevi su kationski, važno je da većina njih ima molekulu koja je pozitivno nabijena atomima dušika. Naziv barvnikov selektivno oplođuje jezgre stanica i stoga se nazivaju nuklearnim. Zalihe mogu biti hematoksilin (farb u plavo-ljubičastoj boji), karmin (u svijetlo-crvenoj), safranin (tamno-crveni), azur II (u plavoj). Histološke strukture koje formiraju glavne školjke nazivaju se bazofilne. To su granule u citoplazmi bazofilnih leukocita, jezgri ćelija itd.
Neutralna žutika se uspostavlja u prisustvu vodenih sorti kiselih i bazičnih žutika, na primjer, eozinska kiselina metilen plava. Osim toga, neutralne žutike treba odvojiti, ako istovremeno postoje i bazične i kisele žutike. Strukture koje sadrže i bazične i kisele žutike nazivaju se neutralnim profilom ili polihromatofilne. Kundak mogu biti granule neutroprofilnih leukocita, citoplazma polihromatofilnih eritroblasta itd. Prisustvo histoloških struktura koje mijenjaju boju glavne školjke označava se terminom metahromazija. Zrnatost bazofilnih leukocita, intercelularnog tkiva hrskavičnog tkiva itd. je metahromatski kora. Jedna od najčešće konzumiranih žutika je hematoksilin i eozin.
Postoje posebne kreme od kiselog, bazičnog i neutralnog žutika koje se mogu koristiti za identifikaciju pjevajućih glasova ili struktura. Na primjer, Sudan III dodaje masno tkivo narandžastoj boji, a orcein dodaje elastična vlakna smeđoj boji.
Pripremljeni preparati treba da se rastvore u alkoholima, postanu vidljivi u ksilolu, zatim sipati tanku kuglicu kanadskog balzama i pokriti zakrivljenom čašom. Nakon sušenja balzama, dobićete trajni lijek koji možete koristiti duže vrijeme. Za elektronsku mikroskopiju, preseci se uzimaju na ultramikrotomima, postavljaju na posebne rešetke, u kontrastu sa solima uranijuma ili olova, posmatraju se kroz mikroskop i fotografišu. Mikrofotografije su uklonjene sa objekta i istovremeno tretirane histološkim preparatima.
Pored opisa tankih rezova, postoje i druge vrste histoloških preparata, koji su znatno ređi, posebno u pojedinim slučajevima. Pre njih su brisevi (krv, likvor, sluz i dr.), brisevi (jetra, timus, sluzokoža lojne membrane), brisevi (koji sadrže tkivo, pleuru, cerebralnu membranu, medulu), totalni preparati (klice) ranim fazama razvoj, stanje stvari).
Vitalne (preživljačke) metode za praćenje ćelija i tkanina omogućavaju dobijanje informacija o tim procesima života, šivanju, porubi, rastu, interakciji lima, mojoj reakciji na različite faktore. Za dopunu ovih podataka, koji su dobijeni metodom klasične histologije o ljudskim ćelijama i tkivima, neophodne su uspostavljene metode istraživanja. Studije uživo se provode u živom organizmu ili in vivo. Za praćenje živih ćelija koriste se vikorističke metode za vitalno i administrativno liječenje. U tu svrhu koriste se posebne bobice koje nisu toksične za živa tkiva. U slučaju vitalne oplodnje, žutika se unosi u tijelo žive životinje i ćelije celuloze se selektivno fermentiraju. Tako se ćelije makrofagnog sistema prate na uvođenje tripan plavog ili litijum karmina. Supravitalna fermentacija je fermentacija živih ćelija izoliranih iz tijela. Tako se otkrivaju lizozomi (neutralni crveni bojnik), mitohondrije (Janus zeleni) i krvni retikulociti (dijamant-krezil plavi).
Za vitalni ili intravitalni, kao i postvitalni pregled neočuvanih histoloških objekata koristi se niz posebnih metoda svjetlosne mikroskopije – fazni kontrast, tamno polje, fluorescencija.
Metoda faznog širenja osigurava neophodan kontrast prije praćenja neapsorbiranih struktura iza okvira posebne prstenaste dijafragme koja se uklapa u kondenzator i takozvane fazne ploče koja se uklapa u sočivo. Ovakav dizajn optike svjetlosnog mikroskopa omogućava vam da preokrenete fazne promjene svjetlosti koja prolazi kroz objekat, na amplitudu, koja označava oko kao promjenu svjetline.
Glavni Objekti istrage To su histološki preparati, a glavna metoda istraživanja je mikroskopija.
Histološki uzorak može izgledati transparentan (tanak) i kontrastan. Vino se priprema od živih i mrtvih (fiksnih) struktura. Lijek se može koristiti kao suspenzija tkiva, razmaz, tekućina, talog, totalni preparat i tanki rez.
Proces pripreme histoloških preparata za mikroskopski pregled obuhvata sledeće glavne faze: 1) uzimanje materijala i njegova fiksacija; 2) ojačani materijal; 3) priprema uzoraka; 4) priprema ili kontrastiranje očiju; 5) postavljanje očiju.
Za pripremu se koriste specijalne histološke žutike s različitim pH vrijednostima: kiselim, neutralnim i bazičnim. Strukture koje se njima obrađuju se očigledno nazivaju oksifilne, neutrofilne (heterofilne) i bazofilne.
Koje metode koristi histološka nauka? Smrad je brojan i raznovrstan:
Svetlosna mikroskopija. Današnji mikroskopi proizvode podatke visoke rezolucije. Razdvojenost se definira kao najmanja udaljenost (d) između dvije susjedne tačke koje se mogu razdvojiti. Ovu vrijednost treba dugo držati na svjetlu (λ) i izražava se formulom: d = 1/2 λ.
Minimalna vrijednost vidljivog dijela je u rasponu od 0,4 µm. Stoga, maksimalni izlaz svjetlosnog mikroskopa postaje 0,2 mikrona, a maksimalni kapacitet dostiže 2500 puta.
Ultraljubičasta mikroskopija . Dubina ultraljubičastog svjetla je 0,2 mikrona, međutim, odvojeni dio ultraljubičastog mikroskopa je 0,1 mikrona, a kako je ultraljubičasto zračenje nevidljivo, onda je za zaštitu objekta neophodan jedan luminiscentni ekran.
Fluorescentna (luminiscentna) mikroskopija. Kratkotalasna (nevidljiva) vibracija, koja bledi pored reka, budi njihove elektrone, koji blede u svetlost sa većim talasom dugog dometa, ostajući u vidljivom delu spektra. Na taj način se traži napredak u odvojenim dijelovima mikroskopa.
Mikroskopija faznog kontrasta Omogućava vam da prikažete nesačuvane objekte.
Polarizaciona mikroskopija Proučava se razvoj arhitektonike histoloških struktura, na primjer, kolagenih vlakana.
Elektronska mikroskopija daje mogućnost uvrtanja objekata, povećavajući se desetinama hiljada puta.
Mikrofotografija i mikrokino . Ove metode vam omogućavaju da snimite objekte na fotografijama i žive mikroskopske objekte u Rusiji.
Histo –i citohemija , uključujući kolkisnu, omogućava jasnu analizu sljedećih objekata na tkivnom, ćelijskom i subćelijskom nivou.
Citospektrofotometrija Omogućuje pletenje kilkisnih umjesto ovih i drugih bioloških materijala u tkanim tkaninama i tkaninama na bazi svijetle boje gline dovezhiny s pletenim berbetom.
Diferencijalno centrifugiranje Omogućava vam da odvojite ćelije koje su odvojene jedna od druge svojom vlastitom masom.
Radiografija Zasniva se na uključivanju radioaktivnog tragača (na primjer, radioaktivnog joda, N-timidina, itd.) u proces izmjene.
Morfometrija omogućava mjerenje površine i volumena ćelija, njihovih jezgara i organa pomoću dodatnog okulara mikrometara i posebnih mreža.
Zastosuvannya EOM za automatsku obradu digitalnog materijala.
Metoda kulture tkiva Podržava vitalnost tijela i strukturu ćelija i tkiva. U tu svrhu stvaraju se posebne posude sa živim medijem u kojima se stvaraju sve potrebne tvari za život stanica. Ovom metodom moguće je proučavati diferencijaciju i funkcionalno formiranje ćelija, obrasce njihove maligne degeneracije i razvoj procesa bubrenja, međućelijsku interakciju, nivo ćelija i tkiva virusima i mikroorganizmima, priliv lekovite droge na procese razmjene u klijentima i tkivima itd.
Prizhitteve (vitalne) farbuvannya Koristi se za proučavanje manifestacija fagocitoze i aktivnosti makrofaga, filtracije neuronskih kanala itd.
Metoda transplantacije tkiva. Ova metoda se zasniva na metodi promjene ponašanja stanica i njihovog morfofunkcionalnog stanja kada se transplantiraju u drugi organizam. Na primjer, ova metoda se koristi za održavanje života stvorenja koja su dovoljno jaka da prime smrtonosnu dozu.
Mikromanipulacija. Ova metoda se zasniva na molekularnoj biologiji, genetskom inženjeringu, kao i kloniranju, pri čemu se upotrebom mikromanipulatora uklanja jezgro jajne ćelije sa haploidnim setom hromozoma i u nju se transplantira jezgro somatske ćelije sa diploidnim setom. hromozoma.
Predmet histologije. Metode histoloških istraživanja. Klitinova teorija.
UVOD U HISTOLOGIJU. BUDOVA KLITINI.
Predavanje 1
Histologija– ovo je nauka o životu, razvoju i vitalnosti tkiva materije. Tkanine se tkaju od živih i neživih tijela. Pregled histoloških objekata i njihovih suptilnih struktura vrši se uz pomoć mikroskopa, koji stotine hiljada puta uvećavaju detalje nevidljive golim okom.
Kurs histologije je inteligentno podijeljen u sljedeće dijelove:
1. Citologija je nauka o ćelijama.
2. Embriologija je nauka o razvoju, od rođenja do konačnog formiranja tijela.
3. Tajna histologija je nauka o tajnim obrascima koji upravljaju tkivima.
4. Privatna histologija - nauka o Budovi, razvoju organa i sistema.
Osnovni zadaci histologije kao predmeta su sticanje znanja o mikroskopskom i ultramikroskopskom tkivu, organskom tkivu i sistemima zdravog tijela, te neurološkoj povezanosti sa njihovim razvojem i uspostavljenim funkcijama.
Glavne metode histološkog pregleda su mikroskopija i posebne (nemikroskopske) metode (histohemija, citofotometrija, autoradiografija itd.).
Predmet istraživanja mogu biti žive ili mrtve (fiksne) ćelije i tkiva.
Za ispitivanje ćelija i tkiva pod mikroskopom se pripremaju histološki preparati.
Glavne metode za ispitivanje histoloških objekata su svjetlosna mikroskopija i elektronska mikroskopija, koje se široko koriste u kliničkoj i eksperimentalnoj praksi.
Laki optički mikroskopi. Glavni optički dio mikroskopa je presavijen u sočivo i okular. Objektiv ima najpouzdaniji optički sistem, koji daje veću sliku subjekta. Okular je optički sistem koji služi kao lupa dok vizuelno snima veću sliku objekta koju daje sočivo. Okular proizvodi veće slike 5-25 puta.
Dakle, najvažnije karakteristike mikroskopa su njegova efikasnost i uvećanje. Razdvojenost - minimalna udaljenost između dvije tačke objekta, kao što se može vidjeti spolja. Uvećanje mikroskopa je vrijednost koja pokazuje koliko su puta linearne dimenzije slike koju formira optički sistem mikroskopa veće od linearnih dimenzija objekta. Veći mikroskop dolazi od većeg sočiva i okulara, a brojčano veća količina ovih se povećava. Današnji optički mikroskopi imaju raspon do 1500 puta.
Elektronska mikroskopija Elektronski mikroskopi imaju visok nivo raznolikosti. Drugim riječima, u elektronskom mikroskopu, teoretski je moguće poboljšati pojedinačne podatke i očigledno povećati sliku 150.000 puta veću od one kod jednakog svjetlosnog mikroskopa. Najčešće se u morfološkim istraživanjima koriste elektronski mikroskopi koji omogućavaju mjerenje površine slike predmeta koji se istražuje. U budućnosti će se rasterski (skenirajući) elektronski mikroskopi aktivno koristiti za kreiranje trivijalnih slika kako bi se dobio veći prostor za slikovne strukture.
Metode za kvantitativno ispitivanje mikrostruktura u histološkim i citološkim preparatima. Temeljna procjena mikrostruktura je neophodna mentalna identifikacija objektivnih podataka o njihovom stanju u normalnim uslovima, u eksperimentalnim studijama i u patologiji. Glavni pokazatelji mikrostruktura su morfometrijski (broj struktura i njihovi geometrijski parametri) i denzitometrijski, koji odražavaju koncentraciju (optičku snagu) hemijski govori u mikrostrukturama. Za identifikaciju ovih parametara koriste se morfometrijske i spektrofotometrijske metode, kao i automatizovani sistemi za obradu slike.
Skeniranje organizma na nivou tkiva i ćelija zahteva pripremu histoloških preparata i njihovo ispitivanje pod mikroskopom. Metoda pripreme histološkog preparata je priprema materijala za ispitivanje pod mikroskopom kako bi se dobila jasnoća i kontrast.
Često je najefikasnije nanošenje materijala na svjež izgled (na primjer, briga o radu migratornog epitela). Za pripremu preparata uzmite čist predmet. U sredinu stavite kap vode ili fiziološkog rastvora, umotajte uzorke tkanine u nju radi lakšeg pregleda i, pod kontrolom mikroskopa, ispravite ih glavama za seciranje.
Da bi preparat bio kontrastniji i da bi se smanjila sposobnost dobrog odvajanja oko njegovih detalja, predmet se podvrgava preparaciji. Istovremeno, vrijedi napomenuti da različite strukture tkiva i stanica različito reagiraju jedna na drugu.
Priprema trajnih preparata može potrajati dosta vremena, a takvi preparati se mogu obraditi u dužem vremenskom periodu. Preparati se pripremaju od malih celih predmeta (ukupni preparati) ili delova; Za sve umove, predmet kroz sočivo je suptilan i pronicljiv, inače ga je nemoguće ispitati pod mikroskopom.
Priprema lijeka sastoji se od nekoliko faza.
2. Objekti histološkog istraživanja
3. Priprema histoloških preparata
4. Metode istraživanja
5. Istorijski stadiji u razvoju histologije
1. Histologija nauka o mikroskopskom i submikroskopskom životu, razvoju i vitalnosti tkiva živih organizama. Isto tako, histologija je jedan od glavnih aspekata organizacije živog tkiva. Ovi su razdvojeni Hijerarhijski jednaki organizacija žive materije:
clitinny;
tekstil;
strukturne i funkcionalne jedinice organa;
organ rabarbara;
sistemska rabarbara;
organska rabarbara
Histologija kao početna disciplina, uključuje sljedeće dijelove: citologiju, embriologiju, eksternu histologiju (koja uključuje biološke funkcije tkiva), privatnu histologiju (koja uključuje mikroskopski pregled organa).
Glavni objekat Studij histologije je tijelo zdrave osobe i stoga se originalna disciplina zove ljudska histologija.
Glavni zadatak Histologija se odnosi na ranjene ćelije, tkiva, organe, uspostavljanje ligamenata između različitih objekata, uspostavljanje skrivenih obrazaca.
Histologija se, kao i anatomija, proteže na morfološke nauke, head honchos razne modifikacije struktura živih sistema. Umjesto anatomije, histologija proučava živu materiju na mikroskopskom i elektronsko mikroskopskom nivou. U ovom slučaju, modifikacija različitih strukturnih elemenata će se izvršiti u ovom trenutku u skladu s funkcijama koje su im dodijeljene. Ovaj pristup implantaciji struktura žive materije naziva se histofiziološkim, a često se naziva histološkim histofiziologija. Osim toga, sa implantiranom živom materijom na ćelijskom, tkivnom i organskom nivou, može se vidjeti ne samo oblik, veličina i distribucija struktura, već i sastav govora koji te strukture stvaraju. Strukture koje se razvijaju moraju se ispitati u odnosu na njihov razvoj, kako tokom intrauterinog (embrionalnog) perioda tako i tokom postembrionalne ontogeneze. Ovo također objašnjava potrebu uključivanja embriologije prije kursa histologije.
Histologija, kao nauka, ima svoje objekata i metoda Ix vicchennia. Najčešći predmeti koji se koriste za kalemljenje su tkiva, fragmenti tkiva i organi, pripremljeni na poseban način za kalemljenje pod mikroskopom.
2. Objekti istrage dijele se na:
živi (klinini u kapi krvi, klitini u kulturi i drugo);
mrtvi ili fiksirani, koji se mogu uzeti iz živog organizma (biopsija) ili iz leševa.
U svakom slučaju, nakon uzimanja papirića, smrad podleže problemima sa fiksiranjem ili smrzavanjem. U naučne i osnovne svrhe koriste se fiksni objekti. Ovako pripremljeni preparati, a zatim analizirani za ispitivanje pod mikroskopom nazivaju se histološki preparati.
Histološka priprema mozes da vidis:
tanko tkivo organa sa rešetkama;
razmazati kožu;
utjecaj na kožu slomljenog organa;
preparat za tanko pljuvanje.
Histološki preparat bilo kojeg oblika izaziva sljedeće efekte:
očuvati status opstanka objekata;
Budite sigurni da je tanak i bistar da biste ga pregledali pod mikroskopom na svjetlu koje prolazi;
Ako je kontrastna, onda su strukture koje se mijenjaju jasno vidljive pod mikroskopom;
Preparati za svetlosnu mikroskopiju moraju se čuvati i ponovo koristiti duže vreme.
Do njih se može doći u roku od sat vremena od pripreme lijeka.
3. Pogledaj ovo faze pripreme histološkog preparata
Uzmi materijal(komad tkiva ili organa) za pripremu lijeka. U tom slučaju, prikupljanje materijala mora se obaviti prije uginuća ili uginuća životinje, a po mogućnosti i u obliku živog predmeta (biopsija), kako bi se strukture tijela, tkiva ili organa bolje sačuvale. ; Parkiranje šavova mora se izvesti standardnim alatom kako se ne bi ozlijedila tkanina; Tkanina artikla ne mora biti previše rastegnuta za 5 mm, kako bi oznaka za fiksiranje mogla prodrijeti u tkaninu predmeta; Predmeti moraju biti označeni (ime tijela, broj stvorenja ili nadimak osobe, datum preuzimanja, itd.)
Fiksiranje materijala neophodan za ubrzavanje metaboličkih procesa i očuvanje struktura od propadanja. Fiksacija se najčešće postiže upotrebom klina papira u mediju za fiksiranje, a to mogu biti jednostavni alkoholi i formalin i Carnoyeva sredstva za savijanje, Zinkerov fiksativ i drugi. Fiksativ izaziva denaturaciju proteina i na taj način ubrzava metaboličke procese i čuva strukture u prvobitnom stanju. Fiksacija se može postići i zamrzavanjem (hlađenje CO2, rijetkim dušikom, itd.). Ozbiljnost fiksacije određuje posljednji sloj kožnog tkiva ili organa.
Ispuna odeće na sredini klisure(parafin, cijeli, smole) ili zamrzavanje za dalju pripremu tankih rezova.
Priprema kriški na specijalnim alatima (mikrotomija ili ultramikrotomija) uz pomoć posebnih noževa. Srezovi za svjetlosnu mikroskopiju se lijepe na stakalce, a za elektronsku mikroskopiju se montiraju na posebne mrežice.
Zabarvlennya zríziv ili nema kontrasta (za elektronsku mikroskopiju). Prije zabranjivanja posjekotina, zadebljana sredina se uklanja (deparafinizacija). Bačve postižu kontrast sljedećih struktura. Žutika se dijeli na bazičnu, kiselu i neutralnu. Najviše se upotrebljavaju bazične žutike (zvane hematoksilin) i kiseline (eozin). Preklopne školjke često rastu vikoristično.
Prosvetljenje očiju(u ksilenu, toluenu), stavljen u smolu (balzam, polistiren), prekriven zakrivljenim staklom.
Nakon ovih uzastopnih procedura, lijek se može ispitati pod svjetlosnim mikroskopom.
Za potrebe elektronske mikroskopije u fazama pripreme preparata postoje posebnosti, odnosno sami osnovni principi. Glavna briga leži u činjenici da se histološki preparat za svjetlosnu mikroskopiju može sačuvati za vrlo teško vrijeme i da nije kontaminiran. Rezovi za elektronsku mikroskopiju su jednokratni. Prilikom pripreme prvog objekta potrebno je izlučiti, fotografirati, a elektronogramima se vrši implantacija struktura.
Od tkanina rijetke konzistencije(Krv, likvor i dr.) od pojave razmaza na stakalcu pripremaju se preparati koji se takođe fiksiraju, pripremaju, a zatim testiraju.
3 krhka parenhimska organa(jetra, nirka i drugi) pripremaju se preparati za izgled organa: nakon slomljenog ili puknutog organa na slomljeni organ se stavlja predmet na koji se lijepe dekali tkiva. Zatim se lijek fiksira, priprema i primjenjuje.
Zrestha, iz aktivnih tijela(povjetarac, kašasta membrana) ili od pahuljastog vlaknastog tkiva, flotacijski preparati se pripremaju razvlačenjem ili drobljenjem između dvije čaše, također uz postupno fiksiranje, lajanje i ulivanje smole.
4. Glavni metod nadzora biološki objekti koji se analiziraju u histologiji mikroskopsko kupatilo, Odnosno, pregled histoloških preparata pod mikroskopom. Mikroskopija može biti samostalna metoda liječenja, ali inače možete koristiti druge metode (histohemija, historadiografija, itd.). Vrijedno je zapamtiti da se za mikroskopiju koriste različiti dizajni mikroskopa koji vam omogućavaju očitavanje različitih parametara objekata koji se mjere. Ovi su razdvojeni vrste mikroskopije:
svjetlosna mikroskopija (zasebna veličina 0,2 µm) najnaprednija vrsta mikroskopije;
ultraljubičasta mikroskopija (odvojena veličina 0,1 mikrona);
luminescentna (fluorescentna) mikroskopija za identifikaciju hemijskih supstanci u strukturama koje su vidljive;
fazno-kontrastna mikroskopija za implantaciju struktura u nekonzervirane histološke preparate;
polarizaciona mikroskopija za presađivanje, čin glave, fibrozne strukture;
mikroskopija tamnog polja za snimanje živih objekata;
Mikroskopija upadnog svjetla za ispitivanje čvrstih objekata;
Elektronska mikroskopija (razlikovanje do 0,1-0,7 nm), dva tipa transmisione (transmisione) elektronske mikroskopije i skenirajuća ili rasterska mikroskopija omogućava snimanje površine ultrastruktura.
Histohemijske i citokemijske metode omogućava vam da odredite skladištenje hemijskih supstanci i odredite njihovu snagu u strukturama koje su podvrgnute tretmanu. Metoda se zasniva na hemijskim reakcijama koje se izvode sa reagensom i hemijskim supstancama prisutnim u supstratu, sa stvorenim produktom reakcije (kontrastnim ili fluorescentnim), koji se zatim detektuje svetlom ili luminiscentno i mikroskopski.
Histoautoradiografska metoda omogućava vam da identifikujete skladištenje hemijskih supstanci u strukturama i intenzitet razmene za uključivanje radioaktivnih izotopa za praćenje struktura. Metoda se najčešće koristi u eksperimentima na životinjama.
Metoda diferencijalnog centrifugiranja omogućava vam da se okrećete oko organela i fragmenata niti vidljivih iz tkiva. U tu svrhu utrljajte tkivo do organa, napunite ga fiziološkim rastvorom, a zatim ga vrtite u centrifugi sa različitim omotima (od 2 do 150 hiljada) i odvojite frakcije za prikupljanje, koje zatim koriste različitim metodama.
Interferometrijska metoda omogućava vam da odredite suhu masu govora u živim i fiksnim objektima.
Imunomorfološke metode omogućava, pored preliminarnih imunoloških reakcija, na osnovu interakcije antigen-antitijelo, da se identifikuju subpopulacije limfocita, da se odredi stadij stranosti ćelija, da se izvrši histološka tipizacija tkiva i organa ív (što znači histosuiciencija) za transplantaciju organa .
Metoda klitinske kulture(in vitro, in vivo) detekcija ćelija u uzorcima ili posebnim kapsulama u telu i dalje ispitivanje živih ćelija pod mikroskopom.
Postoji samo nekoliko vrsta koje se proučavaju u histologiji
Za vizualizaciju struktura u svjetlosnoj mikroskopiji, važni su mikrometri: 1 µm postaje 0,001 mm; u elektronskoj mikroskopiji, promjena nanometara: 1 nm postaje 0,001 mikrona.
5. U istorijat razvoja histologije mentalno vidi tri period:
Predmikroskopski period(od 4. st. p. n. e. do 1665. r.) povezan je sa imenima Aristotela, Galena, Avicene, Vesalija, Falopije i karakteriše ga testovi uočavanja heterogenih tkiva (tvrdih, mekih, retkih itd.) u telu životinja i ljudi i najbolje metode anatomske disekcije
Mikroskopski period(Z 1665 do 1950). Početak perioda vezuje se za imena engleskog fizičara Roberta Hookea, koji je, prije svega, unaprijedio mikroskop (podsjetimo da su prvi mikroskopi pronađeni početkom 17. stoljeća), odnosno za sistematsko istraživanje znikha, na tom broju bioloških objekata i objavljivanje rezultata ovih studija u 1665 rubalja. U knjizi „Mikrografija“, u trećem, prvom veku, uveden je pojam „klitina“ („ćelul“). Nastavljen je dalji razvoj mikroskopa i dalji razvoj njihovih bioloških tkiva i organa.
Posebno poštovanje odano je vinogradu Budova. Jan Purkinje je opisao prisustvo "protoplazme" (citoplazme) i jezgara u ćelijama stvorenja, a kasnije je R. Brown potvrdio prisustvo jezgara i ćelija kod većine bića. Botaničar M. Schleiden uključio se u aktivnosti ćelija sa citokenezom. Rezultati ovih studija omogućili su T. Schwanu, na osnovu njihovih informacija, da formuliše Clintovu teoriju (1838-1839) u smislu tri postulata:
svi rastući i stvoreni organizmi sastoje se od ćelija;
sve ćelije se razvijaju prema fundamentalnom principu iz citoblastoma;
Ćelija kože ima samostalnu vitalnost, a vitalnost tijela je zbir aktivnosti ćelija.
Međutim, R. Virkhov (r. 1858) nije razjasnio da na razvoj ćelija utiče put ispod izlazne ćelije (da li je ćelija iz ćelije). Principi koje je razvio T. Schwan, klimatska teorija, i danas su relevantni, iako su drugačije formulisani.
Trenutne odredbe ćelijske teorije:
ćelija je najmanja jedinica živih bića;
ćelije stvorenja i organizama sličnih njihovom domaćinstvu;
Reprodukcija ćelija je generisana putem ispod izlazne ćelije;
Višećelijski organizmi su složeni ansambli ćelija i sličnih, ujedinjeni u sisteme tkiva i organa, međusobno povezani ćelijskim, humoralnim i nervnim oblicima regulacije.
Dalji razvoj mikroskopa, posebno upotreba akromatskih sočiva, omogućio je identifikaciju različitih struktura u ćelijama:
Klinički centar Hertwig, 1875.;
aparat za čestice ili parcijalni kompleks ploča Golgi, 1898;
Bendove mitohondrije, 1898
Trenutna faza Razvoj histologije započeo je 1950. godine. Od početka otkrića elektronskog mikroskopa, implantacija bioloških objekata, iako je elektronski mikroskop pronađen ranije (E. Ruska, M. Knoll, 1931). Međutim, sadašnji stupanj razvoja histologije karakterizira korištenje ne samo elektronskog mikroskopa, već i drugih metoda: citohemije, historadiografije i drugih preteranih metoda. U ovom slučaju se koristi kompleks različitih tehnika, koji omogućavaju ne samo jasne indikacije zahvaćenih struktura, već i identifikaciju preciznih karakteristika. Naročito su u upotrebi različite morfometrijske tehnike zasnovane na automatizovanim sistemima za obradu uhvaćenih informacija pomoću računara.
Predavanje 2. Citologija. Citoplazma
Objekti istraživanja mogu biti fiksne (mrtve) ili žive ćelije i tkiva.
Za ispitivanje mikrostrukture sireva i prehrambenih proizvoda u pravilu se koriste fiksirana tkiva i tkiva vikorikulata. Lijekovi su ili trenutni, namijenjeni za jednokratnu injekciju, ili trajni, koji se mogu sačuvati i detaljno pratiti. Osim toga, koriste se totalni i kompletni preparati.
Pravovremene pripreme Možete pripremiti pljosnati švidko; U tu svrhu, materijal se fiksira i izrađuju se rezovi na mikrotomu, koji se zamrzava, ako je dostupan, može se napraviti tanak presek tkiva ili organa skalpelom ili oštricom. Ogulite izrezane dijelove, stavite ih na staklo, zatim nanesite kap glicerina i pokrijte zakrivljenom čašom. Za identifikaciju škroba, rastvorite jod u kalijum jodidu: rastvorite 0,5 g kalijum jodida u maloj količini vode, dodajte 1 g kristalnog jodida i dodajte vodu do 100 cm 3 . Nanesite prskanje reagensa na tanak komad čorbe, praha ili drugog materijala, razmažite na stakalcu i škrob će postati plavo-ljubičaste boje.
Totalne ili kompletne pripreme trag bez uklanjanja tkiva organa. Na primjer, prosutu potkožnu celulozu ili zgnječeni preparat korijena nakon fiksiranja, pranja i pripreme treba staviti između predmeta i zakrivljenog stakla. Za identifikaciju ostalih strukturnih elemenata fiksiranih i fermentiranih komada karlične ćelije ili glatkog mesnog tkiva, čupajte golom kožom na stakalcu – takvi se preparati nazivaju štipanjem. U nizu slučajeva, na primjer, nakon fiksiranja i pranja kore, ne uklanjajte tekućinu s mrežice jabuke ili kože glave, jer u ćelijama postoje organske inkluzije (pigment) koji se prirodno nisu pokvarili.
Metode za pripremu histološkog uzorka Glavna metoda presađivanja fiksnih ćelija i tkiva je histološka. ispitivanje rešetkastog materijala, smještenog u posebnom centru. Za uklanjanje rezova, gotov materijal ulijte u parafin ili cijeli materijal, što vam omogućava da uklonite tanke rezove (ukupno 5-7 µm ili 10-30 µm), za glatku pripremu rezova (40-6 0 µm) koristite tehniku koji će se smrznuti.
Glavne faze pripreme histološkog preparata: uzorkovanje, fiksiranje, pranje, zalijevanje, sipanje do parafina ili cijelog, priprema, polaganje ispod zakrivljene površine.
Izbor uzorka provedeno kako bi se osiguralo pravilno ispitivanje i struktura materijala. Veličina uzorka u prosjeku ne bi trebala prelaziti 2,5-3,0 cm. Uzorci jetre i slezene uzimaju se iz kapsule. Iz srca se uklanjaju fragmenti prednjeg dela srca, tanji su fragmenti membrane, a na jednom preparatu moguće je odrediti topografski izgled epikarda, miokarda i endokarda. Od dna, limfnih čvorova i supraneuralnih žlijezda, povlače se presjeci organa, tako da je ugao okomit na površinu tako da su cervikalne i moždane vene vidljive na preparatu. Ukoliko je potrebno pripremiti preparate za promjenu organa, ostaci trasiranog materijala se režu na kordonu sa zahvaćenim područjem, tako da uzorak izgubi zonu prijelaza kaviteta. Uzorke skeletnih mišića treba rezati tako da se mesna vlakna nalaze u kasnijim i poprečnim presjecima. Uzorke mljevenog mesa, sira i ostalih sastojaka koji se prvo prosijavaju stavite na komad gaze i zavežite koncem. Važno je napomenuti da kada raste grudna šupljina, noge se kolabiraju zbog elastičnosti, što znači da gube lakoću, zatim se u dušnik dišnih organa ubacuje čaša ili humusna cijev i kroz nju se postepeno ubrizgava. . Nanesite šavnu ligaturu na traheju ispod umetnute cijevi i zavežite šav za potpuno zatvaranje. Da biste učvrstili crijevo, prvo vežite dio ligaturama s obje strane za organ koji je određen za fiksaciju. Uzorci su žigosani naljepnicama od debelog papira s oznakom broja i datuma odabira uzorka.
fiksacija, tobto. spasavajući prirodnu (živu) arhitektoniku, koja se provodi kako bi se živa protoplazma struktura prevela u nepromjenljivo stanje. Djelovanje fiksatora se očituje u tome što u tkivima i organima, kao rezultat biofizičkih procesa, dolazi do nepovratne koagulacije proteina. Uzimajući tkivo iz organa, najbolje ga je zaključati u fiksator; Odnos između materijala i omjera pričvršćivanja nije manji od 1:9 (slika 3).
Fiksacija dovodi do određenog jačanja i promjene dužnosti izražavanja. Za fiksaciju najčešće se koriste 10-12% formaldehida, etilnog alkohola i acetona. Za pripremu određene koncentracije sredstva za fiksiranje, 40% formaldehida se razrijedi vodom iz slavine. Etilni alkohol (100% apsolutni ili 96%) koristi se u ovim slučajevima, ako je potrebno identificirati tvari koje su otopljene u vodi fiksativima (na primjer, glikogen). Materijal za istraživanje (na primjer, mozak) je fiksiran u acetonu više od nekoliko godina. Ako se zahvaćeni organ, kao što je cistično tkivo, treba ukloniti, vrši se dekalcifikacija ili upala. Da biste to učinili, spustite mali komad četke (ili bolje rečeno objesite na konac) u 5-8% vodenu otopinu azotna kiselina, koji se mijenja 2-3 puta po komadu. Rezultat dekalcifikacije može se ocijeniti umetanjem tanke glave u četkicu: ako nema potpore, dekalcifikacija je završena. Nakon takvog pro-
Pranje provodi se za uklanjanje tvrdokornog dijela fiksatora, na primjer, nakon fiksacije formalinom, ispiranje se provodi tekućom vodom iz slavine.
Znevodnennya za stvrdnjavanje materijala u etil alkoholu sa početnom koncentracijom: 50-70-100. Za pripremu 50% i 70% alkohola, razrijedite 96% alkohola destilovanom vodom. Za pripremu 100% alkohola potrebno je pržiti bakar sulfat dok se potpuno ne zalije i dodati 96% etil alkohola u bijeli prah. Pri koncentraciji alkohola u koži, materijal traje 1-24 godine u zavisnosti od veličine tkiva, organa; Sa 70% alkohola, materijal se može obrezati rastezanjem nekoliko udubljenja.
Zalivannya biti izvedeni na način da praćenje očiju postane teško, što vam omogućava da držite tanke poglede. U tu svrhu koristite parafin (period perkolacije 1-4 godine), cijeli materijal (period permeacije tri godine). Ako se otkriju masti, onda da biste pratili mekana tkiva i organe, sipajte želatinu.
Sight koristite sanke ili rotacione mikrotome. Najtanji delovi (5-7 mikrona) mogu se pripremiti od materijala ugrađenog u parafin. Materijal ispunjen solidinom priprema se debljine 15-20 mikrona. Za istraživanje mikrostrukture sira i prehrambenih proizvoda u pravilu se koristi tehnologija zamrzavanja. Time se ubrzava priprema lijeka, a tri stupnja zalijevanja i zalivanja se isključuju. Nakon fiksiranja i ispiranja, tkiva predmeta se postavljaju na mekani mikrotomski stepen, koji se zamrzava i reže na dijelove debljine 40-60 µm. Nišani se nose penzlikom do vode, a smrad se ispravlja, nabubri sa pojavom najtanjih sivih ugrušaka.
Priprema proizvoda za povećanje kontrasta različitih struktura u preparatima namenjenim za ispitivanje pod svetlosnim mikroskopom. Proces farbiranja uključuje složene hemijske i fizičke procese, tako da prilikom odabira metode osigurajte selektivnu konzistentnost struktura tkiva pticama pjevicama sa različitim fizičkim i hemijskim svojstvima.
Žutika se dijeli na osnovne (bazne), kisele i posebne. Zovu se strukture koje pripremaju glavni varvari bazofilni, kisele bobice - oksifilni, acidofilni, eozinofilni.
Glavne (bazalne) bobice sadre sadrže hematoksilin, koji priprema jezgre hromatina i druge strukture koje sadrže proteine, plave ili ljubičaste; Karmin, koji čini jezgro svijetle trešnje, safranin - tamne trešnje, tionin - plavi.
Od kiselih štapića dodaje se eozin (ubrizgava citoplazmu u erizipele), pikrinska kiselina (žuta boja), magenta (rana boja), indigo karmin (plava boja).
Kada se proučava mikrostruktura sira i prehrambenih proizvoda, najčešće se kombinuje sa hematoksilinom i eozinom. U tu svrhu prebacite hematoksilin iz vode 1-3 minute; 20-30 minuta isperite vodom, 3-5 minuta stavite eozin u usta i 3-5 minuta isperite vodom. Voda koja se izgubi odstranjuje se filter papirom, nanosi se kap 96% etil alkohola 1-2 minute i zalijeva se 25% otopinom karbonske kiseline u ksilenu ili toluenu. Zatim nanesite 1-2 kapi balzama na posekotinu i prekrijte zakrivljenim rubom.
Za bojnike, koji pripremaju masne inkluzije, često se koristi Sudan 111. Za pripremu barvnika ruzmarina u 95 cm 3 85% etil alkohola dodajte 5 cm 3 acetona i sipajte Sudan III prah dok se natopljena ruža ne ukloni (barvniki moraju biti previše obrezani ). Smjesa se zagrije na 50% i filtrira. Uzorci uzeti na zamrznuti mikrotom stavljaju se u 50% etil alkohol na 1-2 minute, a zatim u Sudan III na 25 minuta. Isprati oči sa 50% alkohola, isprati destilovanom vodom i staviti u glicerin-želatinu.
Kapljice neutralne masti pretvaraju se u narandžastu boju za rakhunok diviziju Sudana III u mastima. Masne inkluzije mogu se otkriti i osmičkom kiselinom, a masne strukture postaju crne.
Vysnovok ispod zakrivljene padine izvoditi na sredini, kako ne bi pustili vjetar i sačuvali rez na duže vrijeme. Tečnost treba razrijediti alkoholima rastućeg potencijala i staviti ispod površine u jalic, kanadski balzam ili glicerin-želatin (lijek se ne smije lijepiti sa alkoholima ili ksilolom).
Priprema preparata prije elektronske mikroskopije. Za istraživanje bioloških objekata koriste se dvije vrste elektronskih mikroskopa: transmisioni (transmisioni) i skenirajući (rasterski).
Princip obrade predmeta za ispitivanje u elektronskom mikroskopu, koji je proziran, zasniva se na istim principima kao i kod optičkih mikroskopa: uzorkovanje, fiksiranje, pranje, odvodnjavanje, polivanje, priprema ultratankih slika, kontrast.
Izbor uzorka provedeno s ciljem proučavanja strukture materijala, po istim pravilima kao i za svjetlosnu mikroskopiju. Zapremina traka gotovog materijala ne smije prelaziti 1 mm3. Glavni cilj metafiksacije je očuvanje tkiva jakmoga što je moguće bliže njegovom normalnom životu.
Fiksacija Za što bolje očuvanje struktura potrebno je zamrznuti reagense koji utiču na pH i izotoničnost, čije su vrednosti određene vrstom tkiva koje se fiksira. Proces fiksacije se odvija u dvije faze: prefiksacija i postfiksacija. Za prefiksaciju koristite 2,5-3% glutaraldehida (pH 7,2-7,4), period fiksacije je 2-4 godine. Post-fiksacija traje 2% (pH 7,2-7,4) - 1-2 godine. Za očuvanje preživjele strukture preporučuje se upotreba niskotemperaturnog fiksatora (0-4 °C) i priprema fiksativa pomoću fosfatnog pufera, kakodilata i vironal-acetatnih spojeva.
Pranje 5-7 puta sa 30%-tnim hladnim alkoholom, na predmet se nanose kožni dijelovi alkohola 30 minuta, zatim. Iscijedite fiksativ dok ne počne oksidativno djelovanje fiksatora.
Znevodnennya izvoditi sa etil alkoholima visoke koncentracije: 30, 50, 70, 96, 100% 30 minuta. Prilikom korištenja određenih metoda punjenja za zalijevanje preporučuje se dodavanje acetona i propilen oksida.
Zalivannya biti zadržani epoksidne smole(araldit, epon ta in.). Polimerizacija smola u kapsulama se vrši u termostatu na 60°C do stvrdnjavanja, obično rastezanjem od 1-2 dB.
Ultra tanke oči drže uz pomoć staklenih noževa na ultramikrotomu, za šta se epoksidni blokovi naoštravaju u obliku višestrano skraćene piramide. Serijske verzije sive boje treba uzeti u kadi sa 10% etil alkohola. Izrezani dijelovi se montiraju na bakrene ili paladijske sjedišta, na čiju površinu se prvo nanosi talina iz kalupa. Da bi se identifikovale potrebne strukture, čestice na ekranima se tretiraju olovnim citratom i uranil acetatom.
Za skenirajuća elektronska mikroskopija Potrebno je fiksirati tragove tragova, održavati ih u dobrom stanju prema tragovima tragova i koristiti ih kao fiksatore. Nakon zalijevanja, cvijeće se lijepi na trimach predmet, turpije se postavljaju u instalaciju i prekrivaju najfinijim kuglom od zlata ili platine. Osim elektronske mikroskopije koja je vidljiva, za skeniranje se mogu koristiti korozivni preparati: tretirani predmet se napuni nekom vrstom otvrdnjavajućih supstanci i nakon toga postaje ljepljiv i površinski. Postoje i replike koje idu putem smrzavanja - čipovanja. U tom slučaju treba promatrati lomljenje površine predmeta. Da bi se povećao kontrast, replike se moraju napraviti turpijanjem metalnih čestica (zlato, platina) ili vugille.
Kontrolišite hranu
